五、磷酸化蛋白质组学常用分析与定量方法.PDF

五、磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几 乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内 的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某 种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3 的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因 组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸 （酯）酶。磷酸化修饰本身 所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接 受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的 奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析 方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或 几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此 派生出磷酸化蛋白质组学 （phosphoproteomics ）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析 定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 6 1] 。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混 合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共 沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam- Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合 质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨 酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化 丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 磷酸化蛋白质 抗磷酸酪氨酸抗体 磷酸蛋白的免疫共沉淀 图14 免疫共沉淀法纯化磷酸化蛋白质。 图片来源：/wiki/Phosphoproteomics 2121 生生命命奥奥秘秘wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm 1.2 固相金属亲和色谱 （IMAC ） 固相金属亲和色谱 （immobilized metal affinity chromatography, IMAC ）是一项较为成熟的磷酸化多肽 分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+ 、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前 发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱- 串联质谱-数据库检索联用的方 法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴 定出了2 16个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有 富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱 的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固 相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯 化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC-capillary RP HPLC-ESI MS/ MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质 组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛 （TiO2 ）技术引 进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO 与磷酸