第十一章_氨基和蛋白质药物的分析.ppt

第十一章 氨基酸与蛋白质 药物的分析 第一节 氨基酸类药物的分析 第二节 蛋白质类药物的分析 二、蛋白质 二、蛋白质的性质 高分子有机物 两性电解质 双缩脲反应 福林酚反应 紫外吸收 280 蛋白质为高分子有机物 蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，另外还具有扩散和沉降作用，粘度大和不透过半透膜等。 沉降常数（S）：是单位引力场的沉降分子下降速度。 扩散常数（D）：指单位浓度梯度、单位时间和单位扩散面积时的扩散量。 粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质的分子量和形状。 蛋白质为两性电解质 蛋白质分子至少具有一个自由氨基和一个自由羧基，具有两性解离性质。 在水溶液中蛋白质的等电点一般偏酸。 由于蛋白质的两性性质，可以进行蛋白质电泳、离子交换。 蛋白质两性解离性质和等电点 双缩脲反应 双缩脲试剂的成分:浓度为0.1 g／mL的氢氧化钠溶液和浓度为0.01 g／mL的硫酸铜溶液。 碱性溶液中，双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物。 双缩脲反应 福林－酚反应（Lowry） ?包括两步反应： （1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质－铜络合物； （2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。 在650nm比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。该法适于微量蛋白的测定。 蛋白质的紫外吸收光谱 第三节 鉴别与检查 一、氨基酸鉴别 茚三酮：溶液均显蓝紫色。 旋光性： 薄层色谱鉴别法 ： 紫外光谱鉴别：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在紫外区有最大吸收。 红外光谱鉴别：压制成溴化钾片，在4000～667 cm-1范围内测定吸收图谱。 二、蛋白质类药物的鉴别 茚三酮：溶液均显蓝紫色。 紫外光谱鉴别：280nm在紫外区有最大吸收。 三 检查 一般检查 蛋白质检查 有关物质 纯度 蛋白质药物的分析 一、蛋白质纯度测定。 二、蛋白质分子量测定。 三、蛋白质药物的含量测定。 四、蛋白质组成氨基酸的分析 蛋白质纯度方法 1、层析纯 2、电泳纯 3、免疫化学法 4、其它方法（分光光度法，酶活力，超速离心沉降） 蛋白质分子量测定 超离心沉降速度 离心沉降平衡 凝胶过滤柱层析 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法 第三节 氨基酸的含量分析 （一）茚三酮法 （二）三硝基苯磺酸法 （三）铜复合物紫外吸收法 （四）甲醛滴定法 （五）非水溶液滴定法 （六）双波长分光光度法 （七）导数分光光度法 （八） HPLC法 （一）茚三酮法 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。 还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色的，最大吸收值的波长为570 nm。 测定范围是0.5-50μg氨基酸。 （二）三硝基苯磺酸法 TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物有二个吸收峰，位于355nm和420nm附近。 酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基酸，吸收值移至340nm处。 （三）铜复合物紫外吸收法 在合适的pH条件下，二分子α-氨基酸与一分子铜离子形成氨基酸-铜复合物。 复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在230nm有最大吸收。 测定范围是50-500 μmol/ml。 适用于蛋白质水解速度和水解程度的测定。 （四）甲醛滴定法 在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结合，使平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。 可用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定。 每释放出一个氢离子，就相当有一个氨基氮。 （五）非水溶液滴定法 非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。 酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱。 弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强。 适合于氨基酸成品的含量测定，测定范围是几十毫克的氨基酸。 非水溶液滴定法 直接滴定法：适用于能溶于冰醋酸的氨基酸。丙氨酸、精氨酸、组胺酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。 回滴法：适用于不能溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。 第四节 蛋白质类药物的含量测定 凯氏定氮法 双缩脲法 福林酚法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝G-250法 BCA法 凯氏定氮法 原理： 当蛋白质与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳和水，而氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸胺，此过程称为“消化”。硫酸铜用作催化剂。 消化完成后，消化液转入凯氏定氮仪反应室中，加入过量浓氢氧化钠，使硫酸胺分解放出氨，借助蒸汽蒸馏法，