中性粒细胞在大鼠急性重症胰腺炎肺损伤中的作用机制论文.docVIP

　　中性粒细胞在大鼠急性重症胰腺炎肺损伤中的作用机制论文 徐军，刘学民，马清涌，潘承恩 【关键词】 急性病 Experimental study on PMN in acute severe pancreatitis orphonuclear neutrophils (PMN) from bronchoalveolar lavage fluid in acute severe pancreatitis (ASP) and to discuss the related mechanism. METHODS: Fortyeight male SD rats odel e point. At scheduled time, bronchoalveolar lavage fluid ethod. The ratio of apoptosis and necrosis of PMN etry and LDH as eability easured. RESULTS: In ASP group, the survival ratio of PMN increased and apoptosis of PMN eability also increased. CONCLUSION: The delay of PMN apoptosis leads to persistent activation and leakage of toxic contents of PMN, acia公司产品，AnnexinvFITC 凋亡检测试剂盒(AnnexinvFITC Apoptosis Detection Kit)系Sigma 公司产品. 采用Hitachi7170全自动生化分析仪，美国BD公司流式细胞仪FACS.calibur，Hitachi600型透射电镜. 1.2方法 将大鼠于实验前12 h禁食，自由饮水，采用100 g/L氯氨酮80 mg/kg ip麻醉，随机分为实验组及对照组，每组各24只. 常规消毒，腹正中切口进入腹腔. 实验组分别于十二指肠及肝门端用小动脉夹暂时夹闭阻断胰胆管. 近肝门端用4号头皮针穿刺胰胆管，1 min内匀速注入35 g/L牛磺胆酸钠1 mL/kg,压迫注射点，5 min后去除动脉夹，逐层关闭腹腔，完成ASP模型制作. 对照组仅翻动十二指肠. 实验及对照组大鼠均每8只为一时间点，分别于术后3, 6, 12 h剖杀. 解剖分离肺，由主气管插入塑料管，注入10 mL PBS液，反复灌洗3次，回收液体，回收率约80％左右. 灌洗液经离心后，分别留取上清及细胞沉淀. 将细胞沉淀用PBS液重新悬浮，用密度梯度离心Percoll 液（密度分别为1.085和1.095）行密度梯度离心（700 g 4℃ 30 min），吸取PMN富集层并进一步洗脱纯化，将所获PMN稀释至 1 mL备用. 肺泡灌洗液及血液乳酸脱氢酶（LDH）检测应用全自动生化分析仪检测. 用光镜及电镜观察肺组织的病理变化. 取肺泡灌洗上清液，测定白蛋白及总蛋白含量，计算白蛋白/总蛋白比值. 1.2.1PMN凋亡/坏死细胞定量取上述PMN悬浮液，加500 μL细胞悬液于试管中,加入5 μL用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin V和10 μL的碘化丙啶(PI)，室温下避光放置10 min，采用膜联蛋白VFLUOS和碘化丙啶双标法，用流式细胞仪双通道检测5000个细胞，激发波长488 nm，发射波长515,.freel. 膜联蛋白Ｖ阳性为凋亡早期细胞，PI阳性为坏死细胞，膜联蛋白V，PI双阳性为凋亡晚期/坏死细胞. 1.2.2肺髓过氧化物酶活性测定取肺组织加邻联茴香胺制成肺组织匀浆. 冻融并超声粉碎，离心后取上清加反应液，在分光光度计460 nm波长下进行2 min扫描，记录第30 s和第90 s的吸光度差值，以此值代表PMN的（MPO）酶活力的改变. 统计学分析： 数据以x±s表示，2组各项参数均采用方差分析进行比较. P 0.05表示差异有统计学意义. 2结果 2.1LDH含量对照组大鼠肺灌洗液中可检测到少量的LDH,但较血中明显减少. 实验组各时段肺灌洗液中LDH显著增加,与对照组有显著性差异(P 0.01)，但各时间点的LDH差异不明显. 对照组大鼠血中可检测到少量的LDH，实验组各时段血中LDH显著增加, 与对照组有显著性差异(P 0.01),但各时间点间无明显差异(Tab 1). 表1ASP各时段MPO活性及血清LDH活性（略） 2.2肺通透指数和PMN凋亡实验组各时段肺通透指数均明显升高，与对照组比较有显著性差异（Tab 2）. 对照组大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡处于相对较高水平，各时间段无显著差异. 实验组大鼠肺泡灌洗液中