家蚕保幼激素环氧蛋医白水解酶的分子克隆.docVIP

家蚕保幼激素环氧水解酶的分子克隆 及初步表达纯化探索 生科院生物科学系10级1班 王亚雯 10092130130 摘要 保幼激素是一种重要的昆虫激素在昆虫的幼虫生长蛹期变态成虫生殖等生长和发育过程中发挥了非常重要的作用。保幼激素环氧水解酶是家蚕保幼激素代谢中的一个重要酶它将保幼激素代谢为保幼激素二醇。。100mM 咪唑洗脱得到的蛋白表达最佳。 关键字 家蚕，保幼激素环氧水解酶3个异戊二烯单位的萜烯类化合物，由咽侧体所分泌，是最重要的一类昆虫激素[1]。它的主要作用是调控昆虫的生长、发育、变态和生殖等[2,3,4]。因为保幼激素的这种特性使其可作为杀虫剂来有效地防治害虫, 所以它是一类具有良好应用前景的新型生物农药。保幼激素环氧水解酶Klaffke等[6]研究了昆虫体内的JHEH, 发现它们对昆虫的生长、发育和繁殖起到了非常重要的调节作用。目前已有对棉铃虫、小菜蛾等昆虫保幼激素环氧水解酶基因的克隆及其原核表达的研究，还有对家蚕保幼激素环氧水解酶的初步晶体学的研究等。JHEH是家蚕保幼激素代谢中的一个重要酶 实验材料 家蚕保幼激素环氧水解酶 实验器材 恒温摇床，超净工作台，可见分光光度计，冰箱，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，PRC仪，高压蒸汽灭菌锅，铁架台，移液器及枪头，锥形瓶，1.5mlEP管，培养皿，15ml、50ml离心管，吸附柱，比色皿 实验试剂 LB培养基，平衡液BL，溶液P2，溶液P3，漂洗液PW，10X multicore buffer，10X BSA，Not I，Nco I，10X 扩增缓冲液 (+MgCl2），2.5mM 4种 dNTP 混合液 (pH8.0)，10μmol/L 正向引物，10μmol/L 反向引物，蒸馏水，5U/μl Taq DNA 聚合酶，缓冲液EB，kana抗生素，IPTG，30%Acr/Bis，pH8.8Tris缓冲液，10%SDS，10%AP，10%TEMED，不同浓度的咪唑溶液 实验步骤 教师准备： 1、目的基因PCR扩增及回收，提取载体质粒，载体和目的基因双酶切 2、双酶切产物纯化回收，连接，转化 学生操作： 筛选阳性克隆（超净台操作） 在1.5ml EP管中加入1ml液体培养基，挑取6个阳性克隆 ，用20ul型号吸头（白色枪头）挑取克隆。克隆应为饱满略透明，菌落边缘光滑，单独生长。 特别注意：挑中一个克隆，把枪头伸到培养基中，来回吹打， 之后将枪头丢弃。不要碰到别的菌落，否则应弃掉该枪头，重新挑选克隆。 摇菌 将EP管放在小架子上，拿到摇床中200rpm,37℃,2h。注意应该保持EP管是倾斜的（45度），这样在摇菌过程中不会沉到管子的底部而导致无法生长。 2小时后，在超净台做菌落PCR的加样工作。在加完样后，这些EP管应该继续在摇床中摇菌，直至PCR结果出来再挑选。 菌落PCR，每组做6个样品（超净台操作） PCR体系 50μl总体系 8个反应的mix 10X 扩增缓冲液 (+MgCl2） 5 40 2.5mM 4 种 dNTP 混合液 (pH8.0) 1 8 10μmol/L 正向引物 1 8 10μmol/L 反向引物 1 8 H2O 39.5 316 5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.5 4 菌液 2 　 注意：可以做成Mix溶液，即把6-8倍体积的混合液（除菌落外的）配好，分装在PCR管中，再到超净台去分别加上菌液。这些操作必须在冰上完成！！！ 注意：标记一定要清楚，不建议写在管盖上，最好写在管身侧面，并注意记录，不要混淆了样品！ PCR反应条件： 电泳 制备1%琼脂糖凝胶：0.8g琼脂糖+80ml 0.5×TAE（或TBE）缓冲液，加热溶解，待凝胶冷却到50℃左右时，加入花青素染料（每80ml琼脂糖凝胶中加8ul染料），轻轻倒入电泳槽水平板上（查看是否插好点样梳），除掉气泡。 凝胶的厚度在大约 0.6－0.7 厘米，不少于0.5 厘米。 待凝胶冷却至凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，使其正好漫过凝胶表面，然后取出点样梳，保持点样孔的完好。将胶板放入电泳槽内，点样孔靠近负极。 配制预染液：染料和6×loading buffer按1:9混合（如1ul染料和9ul的6×loading buffer混合）。预染液可常温或4℃避光保存三天。（以上教师准备） 样品和marker的预染：检测样品和预染液按5:1混合（8ul样品+2ul预染液），预染3分钟。对marker也同样预染。 预染后的样品和marker小心地进行点样。每孔加样10ul。 打开电泳仪和电泳槽电源，电压70V，即可观察DNA样品的泳动，20min－40min。 保种过夜（超净台操作） 挑选菌落PCR结果为阳性的克隆菌液（3个），三个同学每人