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目录 一、干细胞简介 二、ES/EG细胞培养建系技术 （一）、ES细胞的分离 （二）、饲养层细胞饲养法 （三）、无饲养层培养 （四）、ES细胞的原代培养和继代培养 （五）、ES/EG细胞系的特性和鉴定 三、干细胞应用（治疗失明） 一、干细胞简介 1、定义 干细胞（stem cell）：是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞 2、分类 根据细胞分化潜能大小： 全能干细胞（totipotent stem cell） 三胚层多能干细胞（pluripotent stem cell ） 单胚层多能干细胞（multipotent stem cell ） 单能干细胞（monopotent stem cell ） 根据细胞来源不同： 干细胞 ES细胞：存在于早期胚胎内细胞团的全能干细胞。 EG细胞：来自于早期胚胎嵴原始生殖细胞的多能干细胞。 EC细胞：来自于自发或诱发的生殖细胞瘤或畸胎瘤中的多能干细胞。 二、ES/EG细胞培养建系技术 ES细胞建系： 将早期胚胎（桑椹胚或囊胚）与抑制分化物共培养，使之增殖并保持未分化状态，随着传代数的增多，细胞数量越来越多，直到建立ES细胞系。 EG细胞建系： EG细胞在体外培养增殖能力较ES细胞弱，所需条件特别是饲养层较ES细胞严格，所以EG细胞培养建系较ES细胞困难。 （一）、ES细胞的分离 （二）、饲养层细胞饲养法 （三）、无饲养层培养 （四）、ES细胞的原代培养和继代培养 （五）、ES/EG细胞系的特性和鉴定 （一）、ES细胞的分离方法： 1.全胚培养法 ： 将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当ICM增殖垂直向上生长一定时间后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，继代培养，克隆增殖。 2.免疫外科ICM培养法： 先用链酶蛋白酶将胚胎的透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对ICM进行培养和扩增。 3.机械剥离ICM培养法： 采用机械法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。 4.克隆法： 将（转基因）成纤维细胞注入去核哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚。分离ES细胞与全胚培养法相同 （三）、无饲养层培养 原理 : 在细胞培养液中添加ES细胞抑制因子使ES细胞在体外培养环境下保持未分化状态 培养方法 扩张囊胚或孵化胚 分离ICM细胞 挑取形态典型的ICM集落 转入ES细胞培养液中进行剥离 转入培养基进行培养 （四）.ES细胞的原代培养和继代培养 制备好MEF饲养层并添加相应的ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养（37℃、5%CO2和饱和湿度）。离散的ICM或ES细胞重新接种饲养层后，可出现各种细胞集落，挑选生长良好，没有分化迹象的ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般间隔4～5天用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ES细胞。ES/EG的亚克隆对外界条件的要求十分苛刻，如PH，酶，温度，培养液成分，细胞密度以及冷冻复苏等体外不稳定环境因素均影响着ES细胞的分离和克隆。 1、ES细胞的继代培养 初次传代后2～3天将出现小的ES细胞集落。待ES细胞集落充分增值而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。经数次分离纯化后，ES细胞逐渐扩增，后面每隔4～6天传代一次。对ES/EG细胞进行消化传代总的原则是尽量缩短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度且能将集落消化成小细胞团块（图15-3）。 2、ES细胞的冷冻与解冻 在ES细胞传代过程中，因其耐受性差需不断对细胞行冷藏。方法为取对数生长期的ES单细胞悬浮液放入冷冻液中。冷冻液为75%DMEM+15%新生牛血清（NCS） +10%二甲基亚砜（DMSO）冷冻开始温度下降速度保持在13℃/min为宜，当温度下降到-20℃左右时下降速度可调为5℃/min,到-100℃左右时，可迅速投入液氮。 解冻时，从液氮中将冷冻管取出───37℃水浴中直到溶解───70%的酒精消毒冷冻管外壁──加入ES细胞培养液离心2次除去冷冻液──弃去上清液，以培养液重新悬浮细胞───再放入CO2培养箱培养。 三、干细胞应用（治疗失明） 首例利用胚胎干细胞医治失明手术在美实施 2011年7月15日 据美国《华盛顿邮报》及《技术评论杂志》，美国于近日正