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　　恶性疟原虫MSP1论文 张忠广，常志尚，赵恒梅，宫玉香 【关键词】 疟原虫 ［摘要］ 目的 构建恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量1.9万片段（MSP119）毕氏酵母真核表达克隆。方法 利用PCR技术扩增出MSP119，插入pPIC9载体中，鉴定正确的MSP119基因，插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9k中，DNA测序鉴定序列的正确性.freelplified by PCR technique from rebinant vector pPIC9/PFCP2 and inserted into cloning vector pPIC9. Rebinant expression vectors ed by automatic DNA sequencing. By using electroporation transformation, rebinant expression vectors containing MSP119 genes ed into pichia GSll5 cells. ResultsThe positive clones olecular biology is the basis of MSP119 expression in pichia pastoris. ［KEY SP119; gene amplification; plasmodium falciparum; eukaryotic expression;pichia pastoris;polymerase chain reaction 随着分子生物学技术的发展，基因工程疫苗的研制已成为当今世界性热点课题。毕氏酵母表达系统既具有原核表达系统能高效表达外源蛋白的特点，又具有真核生物的翻译后加工功能，使表达的外源蛋白具有生物学活性［1］，所以构建酵母表达克隆意义重大。本文选择恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量19×103片段（MSP119）的编码序列为目的基因，与酵母表达载体pPIC9k进行重组构建，经酶切鉴定后获得MSP119的真核表达克隆。现报告如下。 1 材料与方法 1．1 材料及来源 大肠杆菌(Escherichia c01)DH5a，毕氏酵母(PichiaPastoris)GSll5组氨酸缺陷型表达菌株，pPIC9(8 023 bp,ColElori,AmpR)、pPIC9k(9 276 bp,ColElori,AmpR kanR)，均购自美国Invitrogen公司。质粒pBluescriptks+(2 960 bp，ColElori，Amp+)为实验室保存；pBKS／PFCP质粒为实验室保存。限制性内切酶购自BioLabs；T4 DNA连接酶，TaqDNA聚合酶购自MBI公司；DNA Marker购自Promega公司。 1．2 引物设计与合成 为便于目的蛋白纯化，在下游引物5′端加6个His基因，设计引物如下：上游引物P1：5′CCGCTCGAGAAAAGATTACAAATTTCTCAACATC3′；下游引物P2，5′CGGAATTCCTATTAATGATGATGATGATGATGATTAGAGGAAGAGCAGAAG3′。 1．3 MSP119片段的扩增及回收 取pBKS／PFCP2质粒模板DNA(0．5 g／L) 1 μL在50 μL反应体系中扩增，PCR混和液的组成：引物P1、P2各1 μL，4种dNTP混合物(每种10 mmol／L)1 μL，10×Buffer缓冲液5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，灭菌双蒸水补至50 μL。充分混匀后，置PCR扩增仪中扩增，条件如下：94 ℃预变性5 min； 然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min， 1期张忠广，常志尚，赵恒梅，等恶性疟原虫MSP119毕氏酵母真核表达克隆的构建51共28个循环；最后再72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照华顺公司DNA回收试剂盒说明书进行操作，自凝胶中回收MSP119片段。 1．4 pPIC9／MSP119重组质粒的构建 1．4．1 目的基因及载体的酶切 MSP119片段与pPIC9载体同时用限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ进行酶切，酶切反应在50 μL反应体系中进行，并选用两种酶的切割效率都较高的缓冲液，50 μL反应体系包括：DNA 20 μL(含2 μg DNA)，EcoR Ⅰ 1 μL(10×106U／L)，Xho Ⅰ 1 μL(10×106U／L)，100×BSA 0．5 μL，10×Buffer 2．5 μL，ddH2O 22.5 μL。37 ℃酶切1．5～2．0 h，然后用热灭活法或加入琼脂糖上样缓冲液终止酶切