成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察论文.docVIP

　　成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察论文 张卫泽，陈跃武，哈小琴，陈永清，秦勉，马凌，郭建巍，洪志斌 【关键词】 成人脂肪 【Abstract】 AIM: To explore the methods of isolating and culturing mesenchymal stem cells from adult adipose tissue （ADMSCs） and inducing them to differentiate into cardiomyocytes in vitro, so as to establish a neyocardial regeneration. METHODS: MSCs adult adipose tissue. 5azacytidine (5aza) induced those cells to differentiate into cardiomyocytes. Then the immunocytochemical method and the RTPCR method yocytes after 14, 21, 28 d of additional culture respectively. RESULTS: The morphology of MSCs induced for 14 d yocytes under a phasecontrast microscope. Cardiac troponinI, desmin and cardiac βmyosin heavy chain gene munocytochemistry and RTPCR. CONCLUSION: Adult adipose tissue contains plenty of mesenchymal stem cells yocytes by 5aza in vitro. ADMSCs might be a neyocardial regeneration. 【Keyesenchymal stem cell；adipose tissue；cell differentiation；cardiomyocytes 【摘要】 目的：探索成人脂肪组织来源的间充质干细胞（ADMSCs）体外分离、培养方法.freelin）表达阳性，RTPCR检测心肌β肌球蛋白重链（Cardiac βMHC）基因表达阳性. 结论：成人脂肪组织存在丰富的间充质干细胞且易于分离扩增，体外5aza诱导可使其向心肌细胞分化，可做为心肌再生医学的理想种子细胞. 【关键词】 间充质干细胞；脂肪组织；细胞分化；心肌细胞 0引言 近年有关干细胞移植技术的研究进展对临床治疗心肌终末期疾病带来了前所未有的希望. 国外已有动物实验及小规模临床试验显示自体骨髓间充质干细胞（bone marroesenchymal stem cells，BMMSCs）移植入坏死心肌后可改善心功能［1-2］. 但由于BMMSCs来源有限，其广泛临床应用受到限制. 新近研究发现，同样来源于中胚层的脂肪组织中亦含有一种多向分化潜能干细胞，这种细胞群更易分离，细胞数量多，可以发挥替代BMMSCs的作用［3-6］. 本实验我们通过体外分离脂肪组织源性间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells，ADMSCs)并传代扩增，在体外特定条件下定向诱导，探讨其向心肌细胞分化的潜能. 1材料和方法 1．1材料新鲜脂肪组织（取自兰州军区总医院微创外科中心单纯性阑尾炎患者大网膜，男性，18岁），高糖DMEM培养基（Sigma），胰蛋白酶（Ameresco），Ⅰ型胶原酶（Sigma），优质胎牛血清（Gibco），5氮胞苷（5azacytidine，5aza，Sigma生物），鼠抗人心肌特异性肌钙蛋白I（Cardiac TroponinI，cTNI，美国QED生物）及Desmin mAb（Sigma），FITC标记羊抗鼠二抗（博士德），总RNA抽提试剂盒（上海生工），RTPCR试剂盒（Fermentars）. 1．2方法 1.2.1原代细胞分离培养外科手术室无菌条件下取大网膜脂肪组织约100 mg，去除包膜及血管组织，PBS(含2×105 U/L青霉素和200 mg/L链霉素)冲洗3次以洗去红细胞的污染，眼科剪剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，加2.5 g/L胰蛋白酶5 mL, 0.75 g/L Ⅰ型胶原酶5 mL，37℃恒温水浴箱振荡消化60 min，弃上层脂肪及上清，加含150 mL/L FBS的DMEM培养基10 mL吹打成混悬液终止消化，3000 r/min离心10 min，弃上清，最底层细