成骨细胞异体移植的免疫学初探论文.docVIP

　　成骨细胞异体移植的免疫学初探论文 .freelmunologicalreac-tion Abstract:AIMTodetectthecellularimmunityandhu-moralimmunityofdifferentstirpsosteoblasttransplantation，andtodiscussthepotentialimmunologicalmechanismandfindthereliabalcellsourceoftissue-engineered-bone.METHODSTheosteoblastsofthesameventer，allostrip，heterogeneityandautogeneityinusmuscleofeachrabbit.Immunologicaltestsandhistologicalobservationed1，2，4and8e.Acellmediatedcytotoxicityeventer，autogeneityandallostriposteoblastscanbethereliablecellsourcefortissue-engineeringbone.Heterogeneitycellsneedtobeprocessedbeforetheyareusedintissue-engineering. 0引言 将组织工程肌肉、皮肤及软骨等组织应用于临床实验的有报道［1］.同时骨及软骨细胞移植在替代治疗及基因治疗中的作用也得到广泛重视［2，3］.我们通过成骨细胞异体移植诱导的体液及细胞免疫水平进行检测，从移植生理学及种系的角度探讨骨细胞移植及组织工程骨种子细胞的可靠来源，进一步确定骨细胞及组织工程骨移植的临床应用价值及适用范围. 1材料和方法 1.1材料①兔成骨细胞原代培养.取材于5in及2.5g L-1II型胶原酶1h消化后，用含150mL L-1新生牛血清的M-199（青霉素/链霉素10万U L-1，谷氨酰胺300g L-1）在37℃，50mL L-1CO2孵箱内培养14d长满单层，胰酶消化传代至第6代，光镜下观察到钙结节，碱性磷酸酶染色进行细胞鉴定.②SD大鼠成骨细胞原代培养［6］.取材于出生后3dSD大鼠颅骨，剪碎后用500mg L-1胰酶及1000mg L-1II型胶原酶混合消化液孵育1h后，用同上培养液37℃，50mL L-1CO2孵箱内培养7d长满单层，胰酶消化传代至第4代，光镜下观察到钙结节，碱性磷酸酶染色法进行细胞鉴定. 1.2方法大耳白家兔40只（其中同胎12只），青紫蓝家兔12只，雌雄不限，体质量1.5～2.5kg.青紫蓝12只为同种异系组（B），同胎大耳白兔为同胎移植组（A），另取12只大耳白兔为异种移植组（C），12只为自体移植组（D），4只为正常对照组（E）.2.5g L-1胰酶消化培养细胞成悬液，计数5×1010 L-1.无菌切开动物腹部皮肤暴露腹直肌前鞘，无菌注射器吸取细胞悬液注入鞘下肌袋内（1mL/只），丝线标记，常规关腹.A，B组注入兔成骨细胞，C组注入SD大鼠成骨细胞，D组注入自体耳廓软骨悬液1mL. 1.2.1ELISA法检测血清学抗体预实验:兔成骨细胞为阳性目标抗原，大耳白兔耳廓软骨匀浆上清为无关抗原对照，移植后1L/孔），培育24h，移植后1，2，4和8L/孔，另3孔加无血清M-199液0.1mL/孔为对照.37℃，50mL L-1CO2条件下培养56h，掺入3H-胸腺嘧啶（18.5MBq/孔）培养8h，收集细胞后计数出每分钟闪烁值（cpm），淋巴细胞刺激指数=刺激组cpm/对照组cpm. 1.2.3淋巴细胞细胞毒试验（CMC）96孔板接种成骨细胞（2×105/孔）为靶细胞，每一样本18孔，孵育24h后弃培养液.淋巴细胞转化试验中分离的淋巴细胞悬液为效应细胞，将每一样本的淋巴细胞悬液0.1mL按100∶1，80∶1，60∶1，40∶1和20∶1的效靶比接种于相应个孔，每稀释梯度3孔，另留3孔不加淋巴细胞为无杀伤对照，设5孔只加淋巴细胞的阴性对照孔，每一稀释梯度加一孔（0.1mL/孔），培养4h后用完全M-199液冲洗各孔3次，每孔加入0.1mL完全培养液和10μL5μg L-1的MTT染液继续培养3h，PBS洗2遍，每孔加入DMSO原液0.1mL/孔片刻，492nm波长酶联吸光光度仪测A值.杀伤活性（%）=（实验孔A-阴性对照A）/无杀伤对照A×100. 1.2.4组织学检查注射部位腹直肌组块经固定、脱钙、石蜡包埋，在组块断面连续3～5张切片，HE染色，光镜下观察. 统计学处理:采用SPSS统计学软件包对各项检测计量结果进行配对t检验及完全随机方差分析