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论花色苷基因工程改良及其策略　　论文关键词 花色；基因工程；花色苷；植物色素　　论文摘要 基因工程在植物花色改良中正发挥着越来越来重要的作用，综述了植物花色苷基因工程所采用的方法和策略，包括花色苷生物合成基因的分离克隆、基因的遗传转化和基因工程改良的基本策略。　　利用基因工程改良花色是花卉分子育种的重要手段，不再受植物亲缘关系的限制，花色改良的效果通过目测和少量辅助手段即可判断[1]。花色苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质，它是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物各组织细胞的细胞液中，使植物呈现从红、紫到蓝等的不同颜色[2]。花色苷的生物合成途径是被最为广泛而深入研究的植物次生代谢途径，特别在主要模式植物中，已经有了清楚的认识[3]。许多花色苷生物合成途径中的关键酶基因和调节基因均已经从不同植物中克隆到[3，4]。转基因花卉主要用于观赏，易被公众接受，具有传统育种手段难以比拟的优越性，必将给花色改良带来革命性的影响，已成为当前花卉育种研究的热点。　　　　1 花色苷生物合成基因的分离和克隆　　　　植物花色苷基因工程改良遵循一般植物基因工程规律，了解特定色素生物合成途径、克隆关键酶的基因是植物花色基因工程改良理论依据和前提。首先是花色苷生物合成途径基因的克隆，第1个被分离的花色苷合成酶基因是CHS基因，它是从欧芹（Petroselinum cnispum）悬浮细胞用差异杂交分离到的[5]；以后利用转座子标签、PCR扩增、异源杂交、差异cDNA克隆、电子克隆、蛋白质纯化与差异筛选等方法分离克隆到了多个花色苷生物合成相关基因。花色苷的生物合成是从莽草酸代谢途径合成苯丙氨酸和脂肪酸合成代谢合成丙二酰CoA开始，经苯丙烷类途径合成[6]。根据基因对花色苷生物合成的作用可分为结构基因和调节基因[7]。结构基因直接编码花色苷生物合成途径中的生物合成酶类，如PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、F3′H、F3′5′H、ANS、3GT等基因；另一类是调节基因，它们调控花色苷生物合成基因的表达强度和模式，同时控制花色苷在时空上的变化，如AN1、AN2、JAFl3和AN11等[8]。　　　　2 基因遗传转化的方法　　　　基因转化的主要方法有农杆菌介导法[9]、基因枪法 [10]、花粉管导入法[11]、化学试剂诱导法[12]和电穿孔法[13]等。　　农杆菌介导的基因转化方法是迄今最可靠、最有效的转化方法。现在的转基因再生植物中，80 %以上是用这种方法获得的，主要有叶盘转化法、整株感染法和原生质体转化法[14]。　　基因枪法又称微弹轰击法，是由康乃尔大学Sanford等[10]建立的基因导入方法，其基本原理是利用亚精胺、聚乙二醇的粘附作用将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。　　花粉管通道法最早由周光宇提出[11]，其基本原则是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道使外源DNA 沿着花粉管进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞的方法。　　化学诱导法[12]的主要原理就是聚乙二醇、多聚-L-鸟氨酸、磷酸钙在pH值较高的条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。　　电穿孔法又称电激法，首先由Neumann提出[13]，是在高压电脉冲作用下，在新鲜分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而发生外源DNA 的摄取。　　此外，还有脂质体转化法、低能离子束法、病毒载体转化法、转座子介导法和浸泡法等。　　　　3 花色苷基因工程改良的基本策略　　　　花色苷合成由多个代谢步骤、多基因决定，所以利用基因工程改造花色苷一个重要策略就是还原法，即欲修饰某个性状时，先要明确决定该性状的特异生化物质，然后对形成该生化物质的代谢途径进行基因工程操作。具体就是分析催化各反应步骤的酶、编码这些酶的基因及其表达调控[15]。多步骤的代谢途径有限速步骤，而限速步骤对整个代谢途径起着决定性作用，所以对限速步骤的遗传操作往往是还原法的重要突破口。增强某种关键酶的表达，往往可使花色苷合成途径朝生成其催化产物的方向进行；而抑制该酶的表达，则会使反应朝合成途径的另一分支进行，导致另一种产物的积累[16]。　　3.1反义抑制法　　利用基因工程技术进行花色苷修饰的常用方法是反义抑制法，首先明确决定花色苷的特异生化物质，然后分析该生化物质代谢途径中催化各反应步骤的酶，克隆编码这些酶的基因，反向转入到目的植株中，外源DNA转录产物与内源的互补mRNA结合，而抑制目的植株中这些生化物质的合成[17]。利用该技术已在矮牵牛[17，18]、菊花[19-21]等几种观赏植物中进行成功了花色修饰。　　3.2共抑制法　　共抑制法，又称正义抑制法，即正向导入1个或几个内源基因的额外拷贝，反而抑制该内源基因转录产物mRNA的积