原位杂交具体步骤.docVIP

原位杂交流程 以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检 测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系 统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、 酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。 主要操作步骤 制备感受态细菌 用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定 大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒 电泳分离、回收及纯化 标记探针 石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理 抗体连接、显色 制备感受态细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 在900ml三蒸水中加入 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g 磁力搅拌使完全溶解用5mol NaOH调节pH至7.0如用进口试剂则不必调。定 容为1000ml高压灭菌20min。 20.1mol CaCl2溶液 1.1g无水氯化钙溶于90ml三蒸水中定容至100ml用0.22μm滤器过滤除菌置 于灭菌试剂瓶中4℃保存。 【材料】 大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。 【操作方法】 1从37℃培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯烧红晾凉挑一单菌 落转入含有5ml LB培养基的无菌试管37℃振摇 200r/min过夜。次日取菌液1ml 加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶37℃振摇培养200300r/min约23h 将烧瓶取出立即置冰浴1015min 2以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心 管中 34℃离心5000g × 10min回收细菌 4弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液 5用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体置冰浴30min 64℃离心5000g × 10min弃上清倒置于滤纸上1min 7加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 重悬菌体动作要轻 8置4℃冰箱1224h即可用于转化。 感受态细菌的冻存 一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中沸水浴 10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份每份加30%体积的甘油充分混匀 置-70℃冰箱一年内可使用。 用含目的基因的质粒转化细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 2氨苄青霉素Amp选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷 却至50℃左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨苄青霉素Amp 选择性培养基则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入即每ml培养 基加入1μl氨基苄。 3氨苄贮存液 将氨苄青霉素钠溶于三蒸水配成50mg/ml溶液以0.22μm滤纸过滤1ml一份 分装存于-20℃。 【操作方法】 1无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的 感受态细菌时将其从-70℃冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200μl 转移至 10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用 2每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min 342℃ 水浴热休克90s不要摇动试管 4每管加无抗生素的LB培养基1ml37℃摇床温和摇振100150r/min45min 5用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精灯烧再晾凉将200μl菌液铺于含氨苄青 霉素的琼脂平板表面37℃放置20min然后倒置培养14