分子实验常见问题及对策程序.docx

分子生物学实验常见问题分析及对策一、各种常见PCR1.PCR反应扩不出条带，出现假阴性，可能原因：（1）模版：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，且含量低；Buffer对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。　　（5）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。解决方案：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量；更换Buffer或调整浓度；重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物；降低退火温度、延长延伸时间。2 出现假阳性　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带不一致，有时其条带更整齐，亮度更高。　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。3.非特异性扩增PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其可能原因：引物特异性差，引物形成二聚体；模板或引物浓度过高；酶量过多；Mg2+浓度偏高；退火温度偏低；循环次数过多。解决方案：重新设计引物或者使用巢式PCR；适当降低模板或引物浓度；适当减少酶量；降低镁离子浓度；适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)，减少循环次数。4.出现片状拖带或抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，模板不纯；Buffer不合适；dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。解决方案：纯化模板；更换Buffer；适当提高退火温度；适量用酶；适当降低dNTP和镁离子的浓度；减少循环次数。二、电泳1.DNA带模糊可能存在的原因和解决方法：1)电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，故需经常更换电泳缓冲液。2)所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，同时核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。3)DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。4)DNA样含盐过高：电泳前通过