蛋白质杂交最新.pptVIP

DAB、 ECL法都能达到纳克的要求。ECL是一种增强显色法，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文章常用。 DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。 Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。 常用显色法的原理 成功的例子 A.RT-PCR; B. Western blot C.Col I mRNA 数据分析 D. Col I蛋白数据分析 杂交结果的分析 Western blot 可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量和半定量分析，但是不能定位。 定量Western Blot技术需要具备两个必要条件。其一：信号必须稳定，保证不同时间点检测都可以得到相同的结果；其二：信号的强弱必须与目标蛋白深度成比例关系。 利用红外激光器产生的激光激发红外荧光染料，产生的发射光由高灵敏度光电二极管检测荧光信号强度。荧光信号一经激发出来就是稳定的，不随时间变化；荧光强弱与目标蛋白浓度成比例关系（浓度越高，结合的染料越多，荧光信号越强），根据荧光强弱就可以对蛋白进行精确的定量分析。 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，有时会有假阳性。 免疫组化定量分析（半定量）：用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记分为0～3 分,着色深度以多数细胞呈色程度为准。常用软件进行处理，如image?pro?plus?5.0（IPP5）。 Western blot 的半定量将图片扫描保存为电脑文件，用分析软件（如：GIS1000）将图片上每个特异条带灰度值的数字化。目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH/Actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 Western Blot常见问题分析 不恰当的样品制备会导致实验失败 新手采用含TritonX-100或NP-40的缓冲液裂解组织或细胞，结果无蛋白条带。因为步骤太多，新手无法保证每一步操作都正确。SDS上样样品中蛋白实际含量较低。 SDS电泳 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？4，5，6，7 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 条带1、2、3、9的形状，属电泳条件比较合适的区带，其余都是电泳条件不太理想所致。 影响区带形状因素：凝胶的孔径，样品的盐浓度，蛋白质的量（如8，量太多，带向下垂），电泳过程中产生的热，点样的位置（如在胶的左、右端的样品，因电压关系常出现歪斜），浓缩胶点样槽的底部不平也造成区带的歪斜。 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 一抗浓度影响结果 一抗浓度太高，导致没有特异带。可能与抗体-抗原结合的所谓空间位阻现象有关，也可能是高浓度抗体导致的高背景会洇灭特异信号。 背景太高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。 如果结果背景较高可以适当