2.1.土壤中分解尿素细菌分离与计数.pptVIP

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数;课题目标;劲猜襟寡纸垣鹊宫惭褒抠根攫愤豢牧拼詹呐榆桅芜捡哇侈用囊搁汐滋酥管2.1.土壤中分解尿素细菌分离与计数2.1.土壤中分解尿素细菌分离与计数;课题背景;3、常见的分解尿素的微生物;一、研究思路;启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。;要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： ⑴抑制大多数微生物使之不能生长 ⑵造成有利于该微生物（如细菌）生长的环境 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。;15.0g;②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？;1.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由样品稀释液中一个单细胞活菌增殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞，通过统计平板上的菌落数推测样品中的活菌数。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)； M：稀释倍数。;旁栏思考：想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的细菌数？;（3）注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度菌液涂布到三个或三个以上的平板上，计算菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。;2、显微镜直接计数（也是常用方法）;（4）计算公式 每毫升原液所含菌数=（每格平均菌数×400）/计数室容积×稀释倍数 （5）缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；;3、膜过滤法：;计 数 法;例题：统计菌落数目的方法有 （ ）;1、设置对照的主要目的：是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。;小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服 力，对照设置必不可少。; 实验设计包括对实验方案、仪器用具、材料、药品，具体步骤及时间安排综合考虑和安排。设计周密细致实验就能有条不紊，集中精力于实验操作，提高成功率和精确性。 流程包括： （一）培养基制备； （二）土壤取样； （三）样品的稀释； （四）取样涂布； （五）微生物的培养与观察；;1、培养基类型：选择培养基 2、培养基特点：尿素为唯一氮源。 3、培养基配方：;4、培养基的制备： （1）计算、称量：按比例和用量准确称取KH2PO4、NaH2PO4、 MgSO4`7H2O、葡萄糖、尿素和琼脂备用 （2）溶化：蒸馏水中加入KH2PO4、NaH2PO4、 MgSO4`7H2O、葡萄糖、尿素后搅拌使溶解充分加入15g琼脂加热熔化，并不断搅拌防止溢出、糊底而至烧杯破裂，琼脂完全融化后补加蒸馏水至1000ml；调pH;（3）灭菌：将50ml培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，包上牛皮纸并用皮筋勒紧，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹（5-8套为一包），放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。 （4）倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时（手摸不烫，但不能凝固时即可），在酒精灯火焰附近倒平板。（倒平板操作同上节） （5）无菌检查： 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，检查灭菌是否彻底后备用。; 土壤中微生物种类多数量大，在富含有机质的表土中有更多的微生物生长，其中大约70%—80%是细菌，细菌适于在酸碱度近中性、潮湿的土壤中生长，绝大多数分布在距地表3—8cm 的土壤层，所以取样时先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 操作提示： 1、取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌； 2、应在火焰旁称取土壤，在火焰附近倒入锥形瓶，赛好棉塞；; 1、不同微生物在土壤中含量不同，常用不同稀释范围的样品液培养，保证菌落数在30—300之间、适于计数平板。 （1）测细菌数量：一般用104 、105 、106倍稀释液培养 （2）测放线菌数量：一般用103、104 、105 倍稀释液培养 （3）测真菌数量：一般用102 、103、104 倍稀释液培养 第一次做此实验时可将稀释度范围放宽一点，如103—107倍的稀释液涂布培养，以保证能选出菌落数在30—300之间的平板进行计数。