复习A蛋白质的化学修饰.doc

一、化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰、蛋白质肽链的交联、蛋白质的位点专一性修饰 1.化学修饰：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰); 但大多情况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧失) 影响蛋白质化学修饰反应进程的因素 （1）蛋白质功能基的反应性； （2）修饰剂的反应性 3.蛋白质功能基反应性是通过其亲核性来测量的，而亲核性又常常与其酸碱性(即pK值)有关 4.蛋白质的功能基所处的环境（强烈地影响其理化性质，其分子的表面特征也影响化学试剂的接近）： （1）微区的极性。决定基团解离状态的关键因素之一。从整体来看，局部极性的改变对氨基酸反应性影响：Tyr、Cys、-COOH -NH2、His Trp、Met和胱氨酸。 （2）氢键效应。天然蛋白质或其离子通过氢键维持其稳定性，也是使pK值发生改变的一个因素；因此在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK值应比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。 （3）静电效应。由于带电基团相互影响，导致同种氨基酸残基在不同的蛋白质中pK值存在差异。 （4）空间障碍(位阻效应)。处于蛋白质表面的功能基, 一般来说比较容易与修饰剂反应, 但如果烷基在空间上靠近功能基团, 会使修饰剂不能与功能基团接触, 出现位阻效应。此外，其它因素也能改变蛋白质功能基反应性，如电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等。 5.超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。 6.“蛋白质功能基的超反应性”的影响因素： （1）改变蛋白质功能基的pKa值； （2）蛋白质功能基具有较大的亲核性； （3）通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向； （4）试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性； （5）试剂的结合 7.修饰剂反应性的决定因素 （1）选择性吸附 （2）静电相互作用。带电的修饰剂能选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位；此外，静电排斥力能抑制修饰作用。 （3）位阻因素 （4）催化因素 （5）局部环境的极性。疏水环境能阻止产物中电荷分离的反应。 蛋白质侧链的修饰 蛋白质侧链的修饰：主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其重要作用是用于探测活性部位的结构。 （1）理想情况下, 修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反应, 很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。 （2）在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。 2.特定的AA残基侧链基团的反应试剂 （1）酰化及其相关反应。这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟(DFP)、酸酐磺 酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温(20oC~25oC)，pH 4.5 ~9.0的条件下可与 蛋白质某些侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化反应。 （2）烷基化反应。此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子，因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。 （3）氧化和还原反应。H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能将侧链基团( -SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用;2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要用于-S-S-的还原剂;连四硫酸钠或钾是一温和的氧化剂，常用于-SH的可逆保护剂。 （4）芳香环取代反应。蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物，这种产物有特殊光谱，可用于直接的定量测定。 （5）其它反应。另外，还有一些蛋白质与化学试剂的重要反应，如溴化氰(CNBr)裂解, 在自发和诱导重排的条件下主要导致Met残基的-COOH侧链肽键的断裂。 3.巯基具有很强的亲核性，是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 4.巯基的化学修饰（常用的修饰剂有） （1）烷基化试剂：特别是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH修饰剂。修饰产物相当稳定，易于分析。此类试剂还能与Met\Lys\His反应。 （2）N-乙基马来酰亚胺的修饰反应具较强的专一性，与SH形成对酸稳定的衍生物；并伴随光吸收的变化，易通过光吸收