糖核酸蛋白质和脂类组化.pptVIP

甲基绿和派络宁的单染和双染 2. 吖啶橙 (Acridine orange, AO)法: a. 原理: C17H19N3·HCl·ZnCl2, 荧光染料, 488→515nm. 进入活细胞核酸碱基间与磷酸根结合. AO与结构紧密的DNA结合少, 与结构松散的RNA结合多, 分别呈现黄绿色和橙红色荧光. Cultured kidney cells stained by AO, nuclei DNA yellow, cytoplasm RNA orange b. 步骤: *. Carnoy液(或4℃冷丙酮乙醇或80%乙醇)固定, 石蜡或冰冻切片. *. 石蜡切片脱蜡入水, DDH2O洗. *. 1%醋酸洗15~20秒. DDH2O洗10~15秒. *. pH 6.0, 0.1% AO染液10~15秒. *. 磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer, pH6.0)洗1分, 22%CaCl2液20~25秒. 磷酸盐缓冲液洗10~15秒. *. 切片湿封, 荧光显微镜观察照相. c. 结果: DNA呈黄绿色荧光, RNA呈桔红色. d. 注意事项: 不能用福尔马林和Bouin液固定. 多糖也可染成红色. AO-EB (Ethidium bromide, 溴化乙锭, C21H20BrN3)染色. 可见正常或凋亡细胞核为绿色圆形或不规则. EB: 荧光染料, 302→590nm, 红色荧光, 只对死细胞着色, 并能淬灭AO荧光. IV. 蛋白质组化 A. 显示方法: 蛋白质的呈色反应决定于所含氨基酸的化学集团或氨基酸之间的化学键. 因不同蛋白中含有的氨基酸种类和比例不同, 因此组化法检测蛋白质含量和种类比较粗略. 常用氨基酸染色法有以下几种. B. 茚三酮(Ninhydrin)-Schiff法: 1. 原理: 茚三酮(C9H4O3)在中性条件下氧化蛋白质中α氨基酸的氨基(Amino-group, -NH2)生成醛基, 后者与Schiff试剂反应呈紫红色. * 第三章. 糖, 核酸, 蛋白质和脂类组化 (Histochemistry of Sugar, Nuclear Acid, Protein and Lipid) I. 缓冲液(Buffer): 能够对抗外来少量强酸和强碱, 而不引起自身pH大幅改变的溶液称缓冲液. 缓冲液不应干扰化学反应. A. 作用: 溶液pH值对化学反应十分重要. 1. 所有酶均有最适pH. pH值变化1~2个单位, 酶促反应速度明显降低. 2. 生物聚合体反应基的离子化程度明显影响该反应基和组化试剂间的反应, 而离子化的程度则受pH值影响. B. 组成, 原理及配制: 1. 组成: 由足量能对抗强酸和强碱的成对酸碱组分构成. a. 弱酸及其对应的盐, 如醋酸和醋酸钠(Sodium acetate), 乳酸(Lactic acid)和乳酸钠(Sodium lactate). pH7. b. 多元酸的酸式盐及其对应的次级盐, 如NaH2PO4(Sodium dihydrogen phosphate)和Na2HPO4(Disodium hydrogen phosphate). 溶液可酸可碱. c. 弱碱及其对应的盐及其改良, 如三羟甲基氨基甲烷(Trihydroxymethyl aminomethane, Tris, 缓血酸铵)和HCl, 巴比妥钠(Barbital sodium)和HCl等. pH7. 2. 原理: 以HAc-NaAc缓冲系为例: HAc为弱酸, 部分电离. NaAc为钠盐, 全部电离. 痕量水分子电离成H+和OH- (Hydroxyl), 因此缓冲液中有H2O, HAc, Na+, Ac-, H+和OH-, 呈动态平衡. 若少量H+或OH-侵入, 首先与Ac- 或H+结合, HAc的电离达到新平衡, 使pH值基本稳定. 3. 摩尔(克分子)溶液配制: 克分子量. 如H2SO4分子量为98, 1L水溶解98克H2SO4, 得到1M H2SO4, 或2当量(N)H+, 因H2SO4为二元酸. II. 糖类及其衍生物组化: 20世纪60年代以来糖类组化有较大进展. A. 化学分类: 1. 单糖(Monosaccharide): 是寡糖和多糖的基本单位, 如葡萄糖和果糖. 2. 寡糖(Oligosaccharide): 20个糖残基. 寡糖链与蛋白质结合成糖蛋白, 与脂类结合成糖脂. 3. 多糖(Polysaccharide): 20个糖残基. a. 纯多糖(Holosaccharide): 同一种单糖聚合而成, 如糖原 (Glycogen, 动物体内唯一的纯多糖). b. 杂多糖(Heterosaccharid): 糖醛酸和氨基糖为重复单位聚合而成, 故称糖氨多(聚