血清IgG的分离、鉴定11—培训课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 蛋白质-SDS胶束的特点:（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 胶束在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 （2）非还原SDS的基本原理 非还原的SDS处理： 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。 （3）带有烷基化作用的还原SDS的基本原理 带有烷基化作用的还原SDS处理： 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。 A浓缩效应 缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。 （三）三大效应 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 8.3 样品 蛋白质 6.7 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.7 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.8 小 有效迁移率 = 迁移率 ? 解离度 B.电荷效应 蛋白质样品进入分离胶后，pH增大(pH 8.8)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 C.分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。 分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 （四）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度. 10ug 10ug 10ug 20ug 血清原液 20%血清 血清原液 71.4ug 178.5ug 604房 604房 8%分离胶 10%分离胶 12%分离胶 608房 612房 （一）仪器 电泳仪，蛋白电泳系统，pH计，移液枪等 （二）材料 初分离血清IgG蛋白 （三）试剂 （1）30%凝胶贮备液： （2）10％SDS （3）10％过硫酸铵 （4）Tris-甘氨酸电泳缓冲液 （5）SDS凝胶上样缓冲液 （6）考马斯亮蓝染色液 （7）脱色液 （8）1.5mol/L Tris（pH8.8）分离胶缓冲液 （9）1.0mol/L Tris（PH6.8）积层胶缓冲液 三、仪器、材料和试剂 四、实验步骤 1.SDS凝胶的制备 2.加样 取8μL待电泳IgG溶液，再加8μL上样缓冲液置于200μL离心管中混合，离心后沸水中煮沸10min，使蛋白变性。 用移液枪取10μL上述测试样品，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹槽底部，待所有凹形样品槽内都有了样品，即可开始电泳。 3.电泳 （1） 安装好电泳槽，将电极插头与适当的电极相连。 （2）开始时电压为60V，15min后染料进入分离胶后，将电压增加到100V,继续电泳直到染料到达分离胶底部（约45min），断开电源。 4. 固定、染色 切去浓缩胶部分，置于有染色液培养皿中。 0.05%考马斯亮蓝R-250（内含20%磺基水杨酸）染色与固定。 染色30min左右。回收染色液。 5.脱色 用脱色液（用7%乙酸）浸泡凝胶，缓慢摇动0.5h~1h，其间换液多次。 6.用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。 1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避