血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定试验用—培训课件.pptVIP

离子交换色谱（ion exchange chromatography） 以离子交换剂为固定相，利用样品中不同的生物大分子的带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，而将混合物中的不同离子进行分离的色谱技术。 三、纯化（离子交换色谱法） 阳离子交换剂（cation exchanger） 两种离子交换剂 阴离子交换剂（anion exchanger） R-SO3－H+ + Na+←→R-S O3 Na+ + H+ R-NH4＋ OH－+Cl－←→R-NH4+ Cl－+OH－ 离子交换剂的化学成分 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。 通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。 阳离子交换基 强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂 阴离子交换基 强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素 阳离子交换层析过程 离子交换树脂 蛋白质 高离子强度洗脱液洗 高离子强度洗脱液洗 加样 平衡液洗 收集 球蛋白中： α及β球蛋白的pI＜6.5，带负电 而γ球蛋白的pI＞6.5(pI7.3) ，带正电 γ球蛋白先洗脱出来。 白蛋白中： α、β及白蛋白均带负电，挂于柱上 先用低盐洗去α、β球蛋白 再用高盐竞争洗下白蛋白 DEAE纤维素阴离子交换层析: 本次实验纯化采用 操 作 一、盐析 －－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分离 1 取0.5ml血清 2 取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液， 缓慢滴入，边加边摇。 3 混匀后于室温中放置10分钟。 4 8000r/min×10min 5 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。 6 沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化 γ球蛋白用。 洗脱液中蛋白质及盐分的检查 取96孔板一块，上四排加300g/L三氯乙酸溶液 ，下三排加BaCl2液。 从下端管口取1滴洗脱液，滴于300g/L三氯乙酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。 从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。 二、G-25凝胶层析脱盐 （一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备 （二）上样与洗脱： 1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。 2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。 3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5的0.02mol/L NH4Ac缓冲液。 4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测， 20％磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，10滴/管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 5、 BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。 6、平衡再生：继续洗脱30ml。 7、白蛋白样品脱盐。 15滴/管收集 三、纯化（阴离子交换层析） 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗脱， 分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴/管，编号。（纯化的γ-球蛋白） 继续洗脱30ml 将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH4Ac洗脱30ml。 改用0.3mol/L NH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白） 再生： 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac 20ml， 0.02mol/L NH4Ac 40ml。 四、醋酸纤维素薄膜电泳检查 （1）血清 （2）粗分的γ-球蛋白液 （3）粗分的白蛋白液 （4）纯化的γ-球蛋白液 （5）纯化的白蛋白液 样品： 　　 以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。 实验原理 1．准备与点样 2. 电泳（点样面朝下，110V 1h） 3．氨基黑10B染色5分钟 4. 漂洗 2cm 粗糙面 操作步骤 学号 （1）血清 （2）粗分的γ-球蛋白液 （3）粗分的白蛋白液 （4）纯化的γ-球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（2次），每次点样时待干后再点。 （5）纯化的白蛋白液 样品： 影响电泳速度的因素 （1）样品本身：带电量、分子大小、形状。 Q越多，V越大；r越小，V越大； 球形分子纤维状 （2）电场强度：X越大，