Westernblotting 常见问题分析.docVIP

Western blotting 常见问题分析? ?问题 ?可能原因 ?建议解决方案 ?转印膜上蛋白样品量少 蛋白质上样量不足或蛋白样品中目的蛋白的含量低 通过预实验确定最佳的上样量，保证目的蛋白的量在一抗的监测范围内 ? 转 膜 效 率 低 转移缓冲液pH值与目的蛋白的等电点相近，蛋白质带所带的电荷不足以使蛋白泳动转移到膜上 调整转移缓冲液的pH值，使目的蛋白在该环境下带负电利于转移 蛋白质变性不充分 在转移缓冲液中加入SDS，利于蛋白质的变性和转移 转移过程中凝胶和转印膜之间存在气泡，使蛋白转移不完全 操作中使用表面光滑的玻璃棒彻底地赶走凝胶和转印膜之间的气泡 凝胶和转印膜俩侧的滤纸过大相互接触，造成电流直接从滤纸通过，蛋白质没有转移的推动力 将凝胶和转印膜两侧的滤纸裁成与凝胶一般大小，对齐滤纸，转印膜及两侧的滤纸的四边，避免彼此长出边缘的直接接触 转印膜过期或不适合 选用合适合格的转印膜 电压或电流过大 80-100V电压或20mA恒流 转印的时间过短 根据不同的转移装置保证转移的时间 蛋白转移过程中环境过热 应配置冷却装置，保证凝胶和膜处于20度以下 ? 显 色 过 程 中 无 条 带 出 现 所使用的第一抗体、第二抗体及显色方法不合适 选择适于目的蛋白的第一抗体；适于第一抗体的第二抗体；适于第二抗体的显色方法 封闭液中起封闭作用的物质过浓 降低其封闭作用物质的浓度 目的条带含量低于一抗的检测灵敏度 使用合适方法增加目的条带的含量 一抗的效价低或稀释倍数过大 增加一抗的浓度即减少稀释倍数 二抗的效价低 增加二抗的浓度既减少稀释倍数 一抗或二抗的作用时间不足 相应的增加作用时间，保证在37作用的时间在1h以上 一抗或二抗后洗涤的时间和次数过长 减少洗涤的次数和时间，以37，5~10min，三次为好，可酌情减量 二抗的显色时间过长（如辣根过氧化物酶） 如果选用的是在短时间内褪色的二抗显色法应注意避光显色时间不宜太长，显色后即拍照留图 ? 显 色 背 景 过 高 封闭液中封闭物质不足 增加起封闭作用的物质浓度 转印膜未能完全的被封闭液所覆盖，膜上的非蛋白样品的部位暴露未能被封闭物质占据 注意使封闭液完全的覆盖转印膜的每一部分 封闭的时间和温度不够 37下至少应轻轻振摇封闭1h以上 一抗为多克隆抗体，与非目的蛋白条带也有作用 适当的减少一抗的浓度和作用时间，增加洗涤次数 二抗浓度过高洗涤不彻底 降低二抗浓度，适当增加洗涤次数 化学显色底物过多 按照说明适量加入显色剂各种成分 ? 显 色 时 间 过 长 一抗或二抗浓度低 减少一抗及二抗的稀释倍数或增加作用的时间 显色剂底物浓度不足 增加显色剂的用量 显色剂失效 检查相关成分的pH制和质量 目的条带量少于一抗检测的灵敏度 浓缩目的蛋白或增加上样用量 ?SDS凝胶电泳常见的问题分析? 问题 可能原因 建议解决方案 推荐电压条件下电泳时间过长 ?电泳缓冲液过稀 ?配置新鲜缓冲液，使用1×稀释液 推荐电压条件下电流过大，热量过大 ?电泳缓冲液过稀 ?配置新鲜缓冲液，使用1×稀释液 推荐电压条件下电流过低或无电流 接触不良 确认缓冲液浸没过加样孔，检查导线连接 蛋白带型条状（streak） 上样过量 降低蛋白上样量 样品中盐浓度过高 通过透析或凝胶过滤降低样品中盐浓度 样品沉淀 加大样品中SDS的浓度 样品中的污染，如脂类或DNA复合物 离心或过滤样品以除去固定污染物 制胶不佳 确保灌胶均匀，一次完成 条带模糊 蛋白样品部分变形 完全变形蛋白 蛋白样品部分还原 确保加入足够量的巯基乙醇 电泳时间过长 观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间 哑铃型条带或“微笑”条带 上样体积过大导致不完全堆积 使用恰当的上样体积，样品不宜过稀 电泳过程中电场不均匀 如果蛋白浓度已知，上样时确保对称 分离胶表面不平 在制胶时使分离胶表面水平 凝胶过期 在指定的失效期前使用凝胶 ? Western Blotting实验流程 第一步：蛋白样品制备 ????????蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。 ????????RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。 ? 第二步：蛋白定量 ????