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第四章蛋白质的修饰 什么是蛋白质的化学修饰？ 蛋白质修饰后的性质变化:医药领域,工业酶领域 第一节 蛋白质的化学修饰 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 （一）巯基的修饰 （二）氨基的化学修饰 （三）羧基的化学修饰 （四）二硫键的化学修饰 （五）其他基团的修饰 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 (一)巯基的修饰 第一节 蛋白质的化学修饰 (一)巯基的修饰 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 一、蛋白质侧链基团的修饰反应 二、蛋白质位点的专一性修饰 亲和标记（位点专一性抑制剂）：一般是底物、别构效应物、配制（辅酶等）的结构类似物。这类修饰试剂对蛋白质的活性部位具有高度的亲和性。 二、蛋白质位点的专一性修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 2、外生亲和试剂 （1）将卤代烷基衍生物通过腺嘌呤的N-6连到腺嘌呤上，则可形成有效的外生亲和试剂。 二、蛋白质位点的专一性修饰 3、光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。 三、蛋白质的PEG修饰 　　 聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)修饰又称分子的PEG化(PEGalation),是目前蛋白质化学修饰最重要的技术之一,是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。 三、蛋白质的PEG修饰 由于PEG无毒,具有良好生物相容性和血液相容性,使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰的目的主要有以下三个方面: (1)增加稳定性,延长血浆半衰期; (2)降低免疫原性和抗原性; (3)降低毒副作用。 四、蛋白质的化学交联和化学偶联 （一）蛋白质修饰的交联方法和试剂 1、重氮化法 2、戊二醛法 3、过碘酸盐氧化法 4、混合酸酐法 5、碳二亚胺法 （二）蛋白质分子的固定化 1、交联法 2、共价结合法 第二节 蛋白质的分子生物学改造 一、基因突变技术 （一）定点突变 1.重叠延伸PCR技术 2.快速定点突变 3.区域性定向突变——盒式突变 （二）定向进化 1.制造突变体 2.筛选 二、基因融合 Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在1～2d内即可完成点突变过程。 DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。 两个关键问题 一个是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切酶识别位点，使得用以取代天然DNA序列的盒式突变序列可以有效地插入到目标基因中。 可以利用遗传密码的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点。 二是如何得到各种合适的、用以取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段。 DNA的化学合成、引物介导的DNA合成技术。 基因定向进化的步骤 突变: 创造高频率突变 基因突变库的建立 筛选: 高通量筛选系统 基因突变库的活体或离体筛选 基因复制与遗传 体外定向进化的意义 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题。 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’-5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的 定向进化的选择策略 1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。 高通量的筛选体系