木瓜中多糖的提取、分离与鉴定论文.docVIP

　　木瓜中多糖的提取、分离与鉴定论文 摘 要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、复合提取法从木瓜中提取多糖，经过分离纯化后，进行IR鉴定。为木瓜多糖的工业化生产提供了一定的理论依据。 关键词：木瓜；多糖；提取；分离；鉴定 0 前言 多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是一种具有广泛生物活性的大分子。从各种中草药和其他植物中都可以提取分离出多糖，我国近年来对植物多糖，特别是具有中国特色的中草药多糖的药物活性已有广泛报道。 木瓜原名番木瓜.freell，水提时间为30分钟，分别在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃的水浴条件下，提取多糖，用苯酚-硫酸法测定其含量， b加水量对提取率的影响：水浴温度为90℃，水提时间为30分钟的条件下，改变加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法进行测定， c水提时间对提取率的影响：水浴温度为90℃，加水量为40ml的条件下，不同的水提时间对多糖得率的影响， 正交试验 根据单因素实验的结果，选取合适的水平，对其进行优化处理。 （3）多糖的分离、纯化。 ①蛋白质的去除：分别用Sevage法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除样品中的蛋白质。 ②低聚糖等小分子杂质的去除：通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。 ③多糖的柱层析纯化：采用DEAE-52纤维素离子交换柱柱层析方法进行。 依次用0.5mol／L的NaOH、HCl和蒸馏水处理填柱材料至中性，反复处理三次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱。用pH=7.6PBS溶液平衡48小时。称取粗多糖1.0g，溶于少量蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液过柱。用0.1-2.0mol／L的NaCl-PBS溶液梯度洗脱，控制流速为1ml／min，采用部分收集器按5ml／tub收集。以苯酚-硫酸法测吸光值（490nm）作洗脱曲线，根据吸光值将同一组分合并。 （4）多糖的鉴定。 ①淀粉的碘反应：将纯化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2ml，水浴加热，观察颜色是否有变化，同时做淀粉的对比试验。 ②溶解性：称取纯化后的多糖0.5g，加入3ml的水，常温下搅拌，观察其溶解性。 ③还原糖的测定：取0.1 mg／ml的多糖溶液50ml于试管中，在80℃的恒温水浴锅中保温30分钟，吸取6ml，加入4ml的斐林试剂（等体积的斐林试剂A液和斐林试剂B液混合），于590nm处比色。 ④蛋白质的测定：将纯化得到的多糖在190- 400nm处进行UV扫描，观察在250-280nm处没有吸收峰，判断是否有核酸和蛋白质的存在。 ⑤IR鉴定多糖中糖苷键的类型：将多糖与溴化钾烘干后，称取多糖2mg与100mg的溴化钾研磨，压片，置于红外图谱分析仪中作红外分析。 ⑥HPLC鉴定多糖中单糖的组成：用高效液相色谱法对木瓜多糖的单糖组成进行定性鉴定。 样品的处理：称取纯化后的多糖10.0mg，加1mol／L的硫酸2ml，充N2后于100℃水浴加热5h，用BaCO3中和，膜过滤后作为待测样品。 标准液的配制：称取葡萄糖、半乳糖25mg，分别溶于5ml的蒸馏水中，配成5mg／mL的标准液，膜过滤后待用。 色谱条件：以Aglient Zorbax Carbohydrate(4.6×250㎜,5um)糖分析柱为固定相，80%的乙腈为流动相，流速1.0mL／min，柱温25℃。利用示差检测器进行检测，进样量为20uL，分别对葡萄糖和半乳糖标样及样品进行检测。 2 结果与分析 2．1 标准曲线的建立 本研究采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标准建立标准曲线，见图2-1。 由上图可知，回归方程为y=0.0552x+0.0383，R2=0.9981。线性关系较好，可以以此来测定多糖的含量。 2．2 多糖的提取 （1）不同提取多糖方法的比较。 对四种提取法方法进行对比，由吸光值可得其相对得率，结果见图2-2。 图2-2 不同提取方法提取率的比较 比较以上四种提取方法，本研究选定较好的水提醇沉淀法作为提取木瓜中多糖的方法，并在单因素试验的基础上，通过正交试验进行优化提取工艺。 （2）单因素实验。 ①温度对提取率的影响。 由图2-3可以得到，在相同的加水量及水提时间的条件下，在90℃时多糖的得率较高，提取效果较好，分析其原因，可以知道，升温有利于粗多糖得率提高，为获得较高提取率，应选择较高温度，但是温度超过90℃时，不仅多糖的生物活性有可能遭到破坏，而且考虑到大幅度升温会带来能源消耗。综合考虑效比，选择85℃、90℃、95℃作为正交试验的因素水平。 ②加水量对提取率的影响。 水浴温度为90℃，水提时间为3