Gluconobacteroxydans木糖醇脱氢酶基因的克隆表介绍.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：５４～５９ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ木糖醇脱氢酶基因的 克隆表达及木糖醇的转化分析 １ １，２ １ １ 沈晓波 　齐向辉 　朱宏阳 　徐　虹 （１材料化学工程国家重点实验室 南京工业大学食品与轻工学院　南京　２１０００９） （２江苏大学食品与生物工程学院　镇江　２１２０１３） 摘要　从氧化葡萄糖酸杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）的基因组ＤＮＡ上扩增出木糖醇脱氢酶基因 ｘｄｈ，构建了诱导型表达载体ｐＳＥｘｄｈ，导入Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９后获得了高效表达木糖醇脱氢酶基因的 重组菌ＪＭ１０９／ｐＳＥｘｄｈ。通过ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和层析和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００分子筛两步纯化从细胞中得 到纯酶，并对酶学性质进行研究。ＸＤＨ最适还原反应的ｐＨ值为５．０，最适还原反应的温度为 ３５℃；最适氧化反应的ｐＨ值为 １１．０，最适氧化反应的温度为３０℃。重组菌中的ＸＤＨ依赖 ＮＡＤＨ，对ＮＡＤＨ的米氏常数Ｋ ＝５７．８ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反应速率 Ｖ ＝１２０９．１ｍｍｏｌ／（ｍｌ·ｍｉｎ）。 ｍ ｍａｘ 重组菌的ＸＤＨ酶活力为１３．９Ｕ／ｍｇ。利用重组菌和原始菌混合静止细胞转化 Ｄ木酮糖，１６ｈ ２８．０ｇ／ＬＤ木酮糖生成１６．７ｇ／Ｌ木糖醇，而原始菌单独转化只生成８．３ｇ／Ｌ木糖醇。 关键词　葡萄糖氧化杆菌　木糖醇脱氢酶　克隆　表达　木糖醇 中图分类号　Ｑ７８６ 　　木糖醇是一种天然糖醇，具有与蔗糖相当的甜度， 后一步的转化率可达９８％，但在以后的报道中转化率 可作为蔗糖的替代品。此外，还具有抗龋齿的特性及 都不高， ［９，１０］ Ｄ阿拉伯糖醇的最高转化率也只有２６％ 。 其他医疗保健作用，广泛应用于医药、食品等行业［１～３］。 葡萄糖发酵生产 Ｄ阿拉伯糖醇的研究很悠久，其转化 　　目前工业上木糖醇的生产方法主要为化学法，以 ［１１］ 率可达４５％（理论转化率５０％） ，由于Ｄ阿拉伯糖 玉米芯为原料，经过水解、纯化获得木糖，然后化学加 醇转化生成木糖醇的转化率较低［１２，１３］，因此限制了葡 氢生成木糖醇，但此方法的主要问题是资源和能源消 萄糖对木糖醇的转化。研究者发现Ｄ阿拉伯糖醇转化 耗大、环境污染严重。２０世纪７０年代以来，研究者们 生成木糖醇是两个酶催化过程，第一个为Ｄ阿拉伯糖 开始考虑利用微生物转化木糖生产木糖醇［４～６］，但该法 醇脱氢酶（Ｄａｒａｂｉｔｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡｒａＤＨ），第二个为 并没有解决上述问题。近年来以来源丰富的葡萄糖为 依赖于ＮＡＤＨ的木糖醇脱氢酶（ｘｙｌｉｔｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， 底物生产木糖醇受到人们重视，由于在自然界中还没 ＸＤＨ），对转化液成分、酶活力检测后发现ＸＤＨ是限速 有发现直接发酵葡萄糖生产木糖醇的微生物，１９６９年， ［９］ ［７］ 酶 。 Ｏｎｉｓｈｉ等 首先报道了通过三步发酵将葡萄糖转化为