第五章 工程酶 固定化酶.ppt

固定化死细胞一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。 固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。 固定化生长细胞又称固定化增殖细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。 3、固定化细胞生理状态 固定化增殖细胞与固定化酶和固定化死细胞比较， 1、细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定，因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。 2、从理论上讲，只要载体不解体，不污染，就可以长期使用。 3、固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应 固定化细胞的制备 1、化学法涉及酶或细胞的化学修饰。由于所用化学药品的毒性，这类方法可引起细胞破坏。 2、吸附螯合法制备固定化细胞条件温和、方法简便，但载体和细胞间吸附力弱，操作时细胞易从载体脱落，特别是底物分子量高，介质的离子强度和pH变化情况下更是如此，所以操作稳定性差，但优点是可再生。 3、包埋法从理论上来说细胞和载体间没有束缚，固定化后应保持高活力，然而实际上限制酶活力的因素较多，而且这类方法只适于小分子底物。要固定活细胞、增殖细胞显然包埋法占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。 4、交联法没有良好机械强度，所以不适于实际应用。但可得到高细胞浓度，大多数情况难于再生。 辅酶固定化的原因： 辅酶在使用过程中要流失，并且不能自行再生 辅酶价格昂贵 ——工业上应用全酶的关键是辅酶的保留和再生 作为酶的辅因子的有机分子，本身无催化作用，但一般在酶促反应中有传递电子、原子或某些功能基团(如参与氧化还原或运载酰基的基团)的作用，与酶较为松散地结合，对于特定酶的活性发挥是必要的 辅酶的固定化 1、应选择合适的载体。目前使用的载体主要有琼脂糖，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子载体等 2、间隔臂（手臂）的选择也非常重要。一般辅基分子和载体之间需要0.5~1.0 nm长的手臂 将辅酶和酶固定在同一个载体上，可得到一种不需外加辅酶而活性持久的固定化酶。 图2-7辅酶和酶固定化的反应系统 A：辅酶与酶共固定在载体上；B：通过间隔臂将辅因子直接固定在酶分子上 ? 1、概述 （1）基本概念：将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，可得原生质体（动物细胞可视为原生质体），将此原生质体用多孔凝胶包埋，即为固定化原生质体。 （2）固定化细胞的缺陷 a 只能用于生产胞外酶和其它能够分泌到细胞外的产物。 b 由于载体的影响，营养物质和产物扩散受到一定限制。 （3）固定化原生质体的优点： a 促进胞内物质分泌到胞外。 b 有利于氧的传递，营养物质的吸收。 2、、原生质体制备 (1). 制备原则： a 既要破坏细胞壁 ，又不能影响到细胞膜的完整性。 b 不能使细胞内部结构受到破坏。 (2). 制备方法： 主要使用对细胞壁有专一性作用的酶。其制备过程为： a 将对数生长期的细胞收集起来，悬浮于含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。 b 加入适宜的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。 c 分离除去细胞壁碎片、未作用细胞、及胞壁水解酶，从而得原生质体。 (3)、破壁使用的酶： 主要根据细胞壁的主要成分不同而进行选择。 细菌胞壁：主要成份为肽多糖，使用酶为溶菌酶。 酵母胞壁：主要成份为β-葡聚糖，使用酶为β-1.3-葡聚糖酶。 霉菌、真菌胞壁：主要成份为几丁质及其它，使用酶为几丁质酶及其它有关酶 植物胞壁：主要成份为纤维素、半纤维素、果胶，使用酶为纤维素酶和果胶酶等。 (4)、注意事项： a 加入适当的渗透压稳定剂，防止原生质体破裂。 b 应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获得较高的原生质体形成率。 c 加入胞壁溶解酶的种类、浓度、酶作用温度、pH值及作用时间需经过预试以确定最佳作用条件。 3、原生质体固定化 原生质体固定化主要采用凝胶包埋法，常用凝胶有： 琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、光交联树脂等。 4、固定化原生质体的特点： (1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障可增加细胞膜的通透性。有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。 (2)固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。 (3)固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。 (4) 固定化原生质体发酵的培养基中需要