第三章 基因工程设计策略及操作流程.ppt

3 基因工程设计策略及操作流程; 外源DNA;3.4.1 基因的体外连接重组 含目的基因的外源DNA在体外通过限制性内切酶和DNA连接酶的作用与载体连接，获得重组DNA的过程，称为基因的体外连接重组。 基因的体外重组有两种方式：插入式和置换式。;基因体外重组的类型;插入式是用一种限制性内切酶消化载体，在载体上此酶只有一个识别序列，实现外源片段插入载体的切口； 置换式可用两种限制性内切酶或是在载体上有两个识别序列的一种限制性内切酶处理载体，载体被切成大小不等的两个片段，把外源DNA与载体大片段连接，即置换了载体中原有的小片段，形成重组DNA分子。; 形成重组DNA的实质就是催化外源DNA与载体DNA间高效地形成3′,5′-磷酸二酯键，连接方式有很多种，具体使用时要根据外源DNA与载体DNA末端的性质选择合适的方法，以保证连接效率。;DNA连接酶;（1）互补黏性末端的连接 互补黏性末端的产生是由于外源DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割或是用两种同尾酶切割，但用同尾酶切割后产生的重组DNA分子丧失了原有的两种限制性内切酶的识别序列。;黏性末端的连接;A两段DNA的连接;B DNA片断与载体的连接;;;C 载体与载体的连接; 20 μL的互补黏性末端连接反应体系为： 2 μL T4 DNA连接酶缓冲液或E. coli DNA连接酶缓冲液 5 μL外源DNA片段 5 μL载体DNA片段 1 μL T4 DNA连接酶或E. coli DNA连接酶 其它用ddH2O补齐 充分混匀后，16℃过夜连接;连接效率的检测可用琼脂糖凝胶电泳法，以载体酶切片段、外源DNA酶切片段为对照，若只出现两条与对照带相同的条带，表明连接反应失败；若出现一系列新带，表明发生连接。 为了保证连接效率，减少连接过程中的副产物，连接时要注意以下几点：接反应中外源DNA片段和载体DNA片段的浓度、防止载体自身环化、产生两种重组DNA分子。;载体去磷酸化;双酶切法;5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。; 如果把由两种不同限制性内切酶切割产生的平末端DNA片段进行连接，得到的连接产物就丧失了原有的识别序列。 如果将由同一种限制性内切酶产生的平末端DNA片段进行连接，得到的连接产物仍保留原有的识??序列或是出现一个新的识别序列。;平末端片段的连接;（3）末端修饰后的连接 ①片段末端同聚物加尾法： 一个为平末端和一个为黏性末端的DNA片段之间的连接，也可以两个平末端DNA片段间的连接。需要末端转移酶（terminal transforase）催化，在酶的作用下按照5′→3′方向将四种脱氧核苷酸分子的任意一种依次添加到DNA片段的3′-OH末端，形成同聚物poly(dC)或poly(dG)或poly(dT)或poly(dA)。;待连接的DNA片段末端加上长度约10-40个核苷酸的互补的同聚物尾巴后，在T4 DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，重组DNA分子中有缺口的部分可待其转入受体细胞后，利用受体细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶将缺口填补起来。;片段末端同聚物加尾法;②黏性末端修饰为平末端 适用于两个DNA片段末端为非互补黏性末端的情况，也可用于一个片段为平末端另一片段为黏性末端的情况。 将黏性末端改为平末端需要在核酸外切酶Ⅶ（exonuclease Ⅶ，ExoⅦ）的作用下，将双链DNA片段的5′或3′端突出部分的单链断裂，使黏性末端的DNA片段变为平末端。;黏性末端修饰为平末端;（4）末端加连杆的连接 连杆又叫衔接物(linker)，是指用化学法合成的由10-12个核苷酸组成，具有一个或数个限制性酶识别位点的寡核苷酸片段。 将连杆加在待连接的DNA分子的末端，然后用在连杆中具有识别位点的限制性内切酶处理，即可得到具有互补黏性末端的两种DNA片段，再在DNA连接酶作用下实现连接。 ;这种方法适合于具有平末端的两种DNA片段，或是具有平末端和黏性末端的两种DNA片段，也适用于非互补黏性末端的两种DNA片段的连接。;末端加连杆;1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。;;;3.4.2 重组分子的转移;将重组分子导入受体细胞的方法有很多种，如转化、转染、显微注射和电穿孔等多种方式，在转移重组分子时根据受体细胞的区别选择合适的导入方法。 一般原核细胞和低等真核细胞作受体时主要用转化和转染法，而高等动植物的真核细胞作受体时主要用显微注射和电穿孔法。;感受态制备过程;（1）重组分子转入原核细胞 热激法转化（Ca2+有助于转化） 往感受态细胞中加入重组DNA分子 置冰浴中培养30 min后 42℃热休克90s 实现感受态细胞对重组DNA分子的吸收。 ;（2）重组分子转入真核细胞 酵母作为受体细胞的转化与细菌类似，先去除