分子生物学许晓东6.pptVIP

6 分子生物学研究方法（下） ——基因功能研究技术;6.1 基因表达研究技术;6.1.1基因表达系列分析技术;锚定酶(Anchoring Enzyme, AE)要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基。 NlaIII ;6.1.2 RNA的选择性剪接技术;选择性剪切的不同类型 a. 平衡剪切 b. 5’选择性剪切 c. 3’选择性剪切 d. 外显子遗漏型剪切 e. 相互排斥性剪切;6.1.3 原位杂交技术;mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。;Multiplex RNA visualization in cells using ViewRNA FISH Assays;6.1.4 基因定点突变技术;寡核苷酸介导的DNA突变技术;重叠延伸介导的定点诱变;大引物诱变法;6.2 基因敲除技术;6.2.1 基本原理;基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。;用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验;正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞;;Cre重组酶和LoxP序列: Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下： 　　5 - ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT - 3 　　3 - TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA - 5 ;;;6.2.2 高等动物基因敲除技术;模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。;基因捕获法原理示意图;6.2.3 植物基因敲除技术;植物基因敲除及突变体筛选 a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。 b. PCR产物电泳结果。分别代表??生型、杂合子和纯合子PCR条带。;6.3 蛋白质及RNA相互作用技术;6.3.1 酵母单杂交系统;酵母单杂交的基本原理示意图;从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的 转录因子示意图。;6.3.2 酵母双杂交系统;6.3.3 体外蛋白质相互作用技术;GST融合蛋白沉降技术;蛋白质芯片技术;等离子表面共振技术;免疫共沉淀技术;6.3.4 细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET）;;;6.3.5 RNAi技术及其应用;RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。;RNAi作用机制示意图;6.4 基因芯片及数据分析;;6.5 利用酵母鉴定靶基因功能;6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介;;6.5.2 酵母基因转化与形状互补;“两步置换法”制备酵母缺失突变体的流程图;6.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定;酵母的生理生化特性决定了它适合于动植物基因功能的研究。;6.6 其他分子生物学技术;6.6.1 凝胶滞缓???验;拟南芥转录因子与不同DNA元件有不同的结合能力。;6.6.2 噬菌体展示技术;原理 将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋 白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与 “诱饵”相互作用的蛋白质。;噬菌体展示技术的应用;噬菌体抗体库的筛选;6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术