第七章基因芯片技术11.ppt

基因芯片技术及其应用 美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。 同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne Oakridge也参与了该项目的研究和开发。 英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。 世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。 目前全世界有几百家基因芯片公司，有多种生物芯片问世，而且这些芯片的特点较以前密度更高，检测方法更精确，特异性更强的特点。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。 国内目前主要如清华大学（程京）、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立。 2. 什么是基因芯片 生物芯片，将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在的量的一种技术。 基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。 生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。 而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片。 生物芯片的分类 根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。 基因芯片 根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。 其中一类是较长的DNA探针（?100mer）芯片 这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。 另一类是短的寡核苷酸探针芯片 其探针长度为25 mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。 基因芯片的基本原理 任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列： 这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。 原理 -- 通过杂交检测信息 4. 基因芯片设计 一、基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: 探针的设计 指如何选择芯片上的探针 探针在芯片上的布局 指如何将探针排布在芯片上。 确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 数据库搜索 得到关于序列突变的信息及其它信息。 在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性 ２、DNA变异检测型芯片与基因表达型芯片的设计 对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测出发生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。 从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配出现在探针中心时，辨别能力强，而当错配出现在探针两端时，辨别能力非常弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。 ３、cDNA芯片与寡核苷酸芯片的设计 cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息的利用以及各种文库的建立。 cDNA芯片制备方法一般采用点样法，多用于基因表达的监控和分析。 寡核苷酸芯片制备一般采用在片合成方法。优化是寡核苷酸芯片设计的一个重要环节，包括探针的优化和整个芯片设计结果的优化。 ４、寡核苷酸探针的优化设计 基因芯片布局 基因芯片的制作方式 2、光导原位合成法 是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上