第六章重组体的筛选与鉴定2007.pptVIP

1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 ③ Blotting过程 Immuno Blotting ④结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 一、无细胞翻译系统 第六节 转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 二、转译筛选 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性 带纹的位置 载体+外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符？ 三、杂交抑制转译法 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 （2）R-环检测法 DNA-RNA杂交。 1）原理： 2）选择过程 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子