代谢组学样品处理.docxVIP

血液的采集：采血前4h勿喝茶或咖啡，勿吸烟饮酒。尽量了解患者对刺激物（烟、酒、咖啡）和成瘾药物的接触史，供评价结果时参考。采集时间：一般在早晨6-9时采集；采血前患者应禁食6h以上；采血尽量安排在其他检查治疗前进行。尿样的采集：女性患者避免在月经期留取标本，防止混人阴道分泌物，必要时冲洗外阴后留取中段尿检查；新生儿收集尿标本时，应注意冲洗会阴部或采取特殊留尿方式；标本留取后应立即送检。随机尿：即留取任何时间的尿液，用于门诊患者；晨尿：收集早上起床后第一次尿液，此标本适合住院患者的尿液检查；餐后尿：通常在餐后2h收集尿液，此标本对于病理性蛋白尿、糖尿更为敏感；24 h尿：第一天上午8时排空膀胱，再收集以后24 h内所有的尿液标本。NMR样品处理血样处理：用含有肝素钠抗凝的采血管采血，室温下1500r/min低速离心10min，去除全血中血细胞等大分子物质。离心后用移液枪吸取上清（血浆）放入EP管内，进行第二次离心（4℃，20000r/min，10min）以去除血浆中的杂质，保留血浆中的小分子代谢物。离心后吸取上清液放入干净的EP管中，进行样品的冻干处理，然后保存在-20℃低温冰箱中备用。NMR数据采集时，将冻干处理的血浆样品在室温下解冻，将450ul解冻样本移入干净的核磁管内，以1:10的比例缓慢加入重水值500ul，50ul 1%TSP水溶液，混匀，静置5min。样品处理完成后就可直接在核磁共振仪上进行光谱采集。尿样处理：收集尿样的管中加入0.1%的NaN3水溶液作为防腐剂，样品保存在-75℃冰箱中直到NMR测试。NMR测试一般需要300-400ul尿样。从冰箱中取出尿样解冻后，每个样品取400ul，加入200ul重水配置的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L:NaHPO4/NaH2PO4;PH7.4含3mmol/LTSP）混合静置10min；离心13000rpm，10min后取500ul进行NMR测试。GC-MS,LC-MS样品处理血样处理：GC-MS:用含有肝素钠抗凝的采血管采血，室温下1500r/min低速离心10min，去除全血中血细胞等大分子物质。离心后用移液枪吸取上清（血浆）放入EP管内。取100ul血浆，用900ul的甲醇水（8:1v/v）溶液（包含全部内标物）萃取。离心4℃，8000rpm，10min）。取上清200ul蒸干。在做GC-MS之前用30ul甲氧胺（15mg/l）吡啶溶液衍生16h，之后MSTFA衍生1h。之后即可进行GC-MS试验（如物质浓度过高超过检测线可用乙腈稀释）。LC-MS:方法同上，不需要后面的衍生步骤。将蒸干的残留物根据不同的目的用乙酸乙酯等溶液溶解，然后进行LC-MS试验。尿样处理：GC-MS：收集尿样，立刻离心去沉淀，-80℃保存备用。制样时，将尿样在室温溶解3000rpm/min离心10min。取600ul上清液加入内标物，加入400ul无水乙醇，100ul吡啶，50ulECF(Ethyl chloroformate)。40KHZ超声60s。衍生，然后用300ul氯仿抽提，用NaOH（7mol/l）调节水相PH到9-10。在上述溶液中在加入50ulECP再次衍生，漩涡混合30s，1900g离心10min，吹干水相，得到的氯仿相用无水硫酸钠干燥，然后就可以进行GC-MS试验了。LC-MS：收集尿样，立刻离心去沉淀，-80℃保存备用。制样时，将尿样在室温溶解3000rpm/min离心10min。取上清液，用等体积的乙酸乙酯抽提，水层用等体积的己烷洗，五十分之一体积的1M盐酸酸化，然后再用等体积的乙酸乙酯抽提，有机相离心蒸发，残留物用流动相溶解做LC-MS实验。