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基于MAPK通路探究五味甘露药浴散加减方治疗类风湿关节炎药效机制 　　[摘要] 研究发现五味甘露药浴散加减方药浴有良好的抗炎活性，可以明显改善关节炎症程度，对类风湿性关节炎具有一定的治疗作用，推测其可能与调控滑膜细胞MAPK通路有关。该实验通过建立佐剂关节炎大鼠（AA）模型，进一步探讨其调控滑膜细胞MAPK通路的机制。采用酶联免疫法测定给药2周AA大鼠血清中TNFα的水平，免疫组化法测定给药4周踝关节滑膜组织蛋白激酶ERK1/2，p38的含量，采用荧光定量PCR（RTPCR）法检测膝关节滑膜组织中JNK1，ERK1，p38的mRNA表?_。结果显示，与模型组比较，给药2周，可明显降低AA大鼠血清中TNFα的水平（P 　　1 材料 1.1 动物 雄性SD大鼠（SPF级），体重（200±20） g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）201324 1.2 药品与试剂 受试药物：五味甘露药浴散加减方由西藏藏医学院制备，外观为棕褐色固体粉末，有刺鼻香味。经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为五味甘露药材。方药组成：刺柏叶Folium Junipfri 500 g，水柏叶Myricaria pulcherrima 500 g，麻黄Ephedrae Herba 500 g，大籽蒿Artemisia sieversiana 500 g，青稞Hordeum vulgare Linn 100 g，峨参Anthriscus sylvesteis 10 g，喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica Edgew.Heim 10 g，蒺藜Tribulus terrestris 10 g，黄精Polygonati Rhizoma 10 g，乳香Olibanum 10 g，天冬Asparagus cochinchinensis 10 g，决明子Cassiae Semen 10 g，黄葵子Belmoschus manihot L.Medic 10 g，碱花Saponaria officinalis 10 g，甘松Nardostachys chinensis Batal 10 g，岩精Bragzhun 10 g，寒水石Gypsum Rubrrum 10 g，黄硫磺Sulfur 10 g。功能发汗解表，消炎，平黄水，舒筋通络，活血止痛。临床上常用0.04 gmL-1药液浸泡全身或组织。药液制备：将五味甘露药各取等份同时放入容器中，注入开水，浸泡1夜后，拌匀，加热、煮沸，至水分全部吸入药材中。发酵药物冷却至与皮肤温度相近时加入酵母或酒糟，重新装入容器内并密封，置20 ℃左右的室内发酵3 d后，闻之，既有酒味，又有酸味和药味时即可。发酵好的药材中加入适量水，放置1 d，提取出药液，如此连续操作3次，至第3天把3份提取液混合即可 醋酸地塞米松（国药准字批号130123，浙江仙琚制药股份有限公司，规格0.75 mg/片）；完全弗氏佐剂（Freund′s adjuvant complete，Sigma公司，批号#SLBF 9338V，规格1 gL-1灭活结核杆菌）；卡介苗冻干粉（上海瑞楚生物科技有限公司，批号201409，规格60 mg/支）。TNFα ELISA试剂盒（批号YAD2015090302，北京雅安达生物技术有限公司） JNK1抗体，兔多克隆抗体，批号ab199380（德国默克集团密理博中国有限公司）；p38MAPK抗体，兔多克隆抗体，批号ab197348（德国默克集团密理博中国有限公司）；ERK1/2抗体，兔多克隆抗体，批号ab184699[英国abcam艾博抗（上海）贸易有限公司]；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L），批号13152A11；三抗：辣根酶标记链霉素卵蛋白素（HRP/AV），批号13152A11；山羊血清，批号13152A11；显色剂：浓缩型DAB试剂盒，批号K135925C，均由北京中衫金桥生物有限公司提供 Trizol（Ambion公司，货；SYBR Green PCR试剂盒（TAKARA公司，货号RR420Q）；逆转录试剂盒（TAKARA公司，货号639505）；RNaseⅠ（Fermentas公司，货号AM2295）。PCR引物由南京金斯瑞合成 1.3 仪器 2015型转轮式切片机[德国徕卡（Leica）仪器有限公司]；ImagePro Plus 6.0 图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪（美国Thermo公司）； Motic Images Advanced图像分析软件；T100Thermal Cycler PCR仪（BIORAD）；