共聚焦激光扫描显微术—培训课件.ppt

CY3 red CY5 Green Living dye-Green Fluorescence protein(GFP) 下村脩(Osamu Shimomura)1962年从一种水母身上分离出绿色荧光蛋白(GFP) 绿色荧光蛋白GFP分子结构图 GFP是一种由238个氨基酸构成的柱状蛋白。 外围由β折叠片围绕， 内部则是一个线状的α-螺旋通过其长轴从中间穿过。 Douglas Prasher 1992年克隆出了GFP基因 当GFP受紫外光或蓝光激发时，α-螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。 由于这一特点及其无种属限制，GFP作为荧光标签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动。 2008诺贝尔化学奖由下村脩(Osamu Shimomura)、Martin Chalfie 和钱永健 (Roger Tsien)三人分享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑 在GFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP),黄色（EYFP）, 黄绿色（ECFP）和兰色（EBFP）的活体荧光蛋白。 这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高,不需反应基质（substrate）等优点,又称为单标记系统（single tag system）。 The Discovery of Aequorin and GFP 标记CFP和GFP的脑皮质神经元 小鼠脑部邻近神经元可以随机表达不同颜色的GFP(称之为XFPs) 转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍) 加血清48h后，神经干细胞集落内和周边均有GFP阳性细胞。 (荧光＋普通光相差显微镜，荧光相差显微镜×400倍) 最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescent proteins,AFPs)。 红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific sea anemone relative Discoma Striiata 中分离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为DsRed。 1.神经细胞参数测定及三维重建 细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究 五、在神经生物学的应用 2.神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定位 3.细胞内钙离子的测定 细胞内信号传导的研究 钙内流与神经递质释放的关系 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放 4.细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细胞内PH变化 5.荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究 Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin) 6.激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体 7.神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系 与细胞内PH的关系 划痕负载法计算公式 红色：大分子RB200 绿色：小分子Lufic YELLOW RB200只可通过划痕处损伤细胞膜进入 Lyellow可通过划痕及Gap Junction进入 两者进入-黄色 扩散率=Y-R/Total Number 思考题： 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微镜技术在生物医学中的应用。 名词解释： 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP) 光笼锁（caged）化合物技术 Thanks for your attention! 高速采集 Dronpa蛋白 FRAP光漂白 Folu-EGFP-EB3 Tubulin Actin 线粒体 4.细胞内PH及Ca,Na等离子定位、双标记组合、OD值与免疫细胞组化、原位杂交技术相结合 细胞生物学功能 1.粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群 2.激光细胞显微外科及光陷阱(optical trap)技术： 激光刀：细胞穿孔、灼烧细胞器、切割染色体、切除神经细胞突起 光陷阱：利用激光的增强效应，钳制或移动细胞器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除 3.荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP) 高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞连接的多少、细胞骨架的组装等 荧光标记物：CFDAam 细胞间通讯连接的影响因素：PH,Ca2+ ,cAMP等 FRAP荧光粹灭漂白恢复法 举例 荧光染料：二乙基羧化荧光素 (carboxyfluoresce