大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞体外机械拉伸损伤模型建立及评价.docVIP

大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞体外机械拉伸损伤模型建立及评价 　　[摘要]目的 采用FX-4000TTM柔性基底加?d系统建立体外大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞机械拉伸损伤模型，为进一步探讨少突胶质前体细胞在脊髓损伤及修复过程中的作用及机制提供模型基础。方法 采用振摇法体外纯化培养大鼠脊髓少突胶质前体细胞，并进行免疫荧光细胞鉴定。将纯化培养3 d的少突胶质前体细胞随机分为A组（对照组）、B组（拉伸强度5%）、C组（拉伸强度10%）、D组（拉伸强度15%）。采用FX-4000TTM柔性基底加载系统机械拉伸少突胶质前体细胞2 h后，通过倒置显微镜观察各组细胞形态学改变、MTT法检测细胞存活率、双染流式细胞术检测细胞凋亡，对损伤模型进行评价。结果 体外成功培育少突胶质前体细胞且纯度90%。B组拉伸强度对细胞形态及存活没有明显影响，基本不构成损伤。C组和D组细胞存活率较A组显著降低（P 　　[Key words]Oligodendrocyte precursor cells；Cell culture；In vitro model；Mechanical strain；Spinal cord injury 随着现代交通和建筑工业的快速发展，脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的发病率逐年增加，并成为青年人致残的主要原因之一[1-2]。SCI是一种严重的中枢神经系创伤，其原发的机械损伤及贯序的炎症联级反应，均可导致少突胶质细胞大量死亡，引发广泛脱髓鞘病变，造成不可逆的神经功能缺失[3-4]。SCI后具有髓鞘修?湍芰Φ南赴?主要是位于白质的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs），它们能对SCI作出快速响应并增殖分化为具有髓鞘生成能力的成熟少突胶质细胞，参与SCI的修复[5-6]。因此，获得一种简单高效的OPCs培养方法，并建立其体外机械损伤模型，对进一步研究SCI后髓鞘修复及轴突再生的机制具有重要意义 本研究培养大鼠脊髓OPCs并通过计算机控制的FX-4000TTM柔性基底拉伸系统建立体外细胞机械拉伸损伤模型，以期为进一步探讨SCI后OPCs增殖活化的机制建立实验基础 1材料与方法 1.1实验动物 新生（出生48 h内）清洁级SD大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供 1.2主要仪器和试剂 HERAcell 150i培养箱（Thermo Scientific，美国）、恒温定轨摇床（国华，上海）、IX73荧光倒置显微镜（OLYMPUS，日本）、FX-4000TTM柔性基底加载系统（Flexcell，美国）、伯乐680型酶标仪（Bio-rad，美国）、BD FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国） 胎牛血清（Gibco，美国）、DMEM（Gibco，美国）、少突胶质前体细胞培养基OPCM（含PDGF-AA和bFGF，Sciencell，美国）、胰蛋白酶（博士德，武汉）、多聚赖氨酸（Sigma，美国）、鼠抗A2B5抗体（Millipore，美国）、TRITC-免疫荧光二抗（博士德，武汉）、DAPI染色液（博士德，武汉）、MTT试剂（Sigma，美国）、Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒（生工，上海） 1.3方法 1.3.1 OPCs的分离纯化培养与鉴定 本实验参考Chen等[7]的振摇法进行原代大鼠OPCs的体外培养。取新生48 h内SD大鼠脊髓，经胰蛋白酶消化15 min后中和消化，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基将细胞重悬并接种于预先多聚赖氨酸包被的75 cm2培养瓶中。培养至10 d时，可见大量的OPCs伏趴在星形胶质细胞上层。将培养瓶固定在37℃的恒温水平摇床上，200 r/min预震荡1 h以去除小胶质细胞；继续以200 r/min振摇过夜，取细胞上清接种于未包被的培养皿中孵育40 min以去除多余的星形胶质细胞和小胶质细胞，即可获得纯化的OPCs。使用OPCs培养基OPCM制备OPCs单细胞悬液，以1×105/cm2的密度接种于铺有多聚赖氨酸预包被盖玻片的6孔板中，每隔一天半量换液 取纯化培养3 d的OPCs进行免疫荧光细胞染色。4%的多聚甲醛室温固定20 min，漂洗后，Triton X-100破膜，5%BSA室温下封闭30 min。加入稀释的A2B5抗体（1∶200）于4℃过夜，次日，PBS漂洗后加入TRITC-羊抗小鼠二抗（1∶100）避光孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗涤后，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下做免疫荧光细胞鉴定。阴性对照组使用PBS替代一抗，其余步骤相同 1.3.2 OPCs机械拉伸损伤模型的建立 本实验的细胞机械损伤系统由FX-4000TTM柔性基底拉伸装置和BioFl