肿瘤细胞与分化、凋亡(三).pptVIP

细胞凋亡的生物学意义 胚胎发育和形态发生 细胞稳态和免疫机制 衰老 肿瘤发生及化学治疗 细胞凋亡和恶性肿瘤 1 Bcl－2和恶性肿瘤 2 P53和恶性肿瘤 3Bcr-abl和恶性肿瘤 4 PML-RARα蛋白和恶性肿瘤 细胞凋亡干预和肿瘤治疗 1 野生型P53基因介导的肿瘤治疗 2 Bcl－2基因介导的肿瘤治疗 3 泛素－蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗 4 三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗 5 DADS诱导肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡的检测方法 1 台肦蓝（trypan blue)染色法 原理：trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料。坏死细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色。因此，该法能区分细胞的生存状态，简单、便捷、常规用于细胞死亡的初步评价和细胞存活率评价。 注意事项：该法不能区别继发性坏死和真正意义上的坏死细胞；也容易低估细胞死亡程度。（因为早期凋亡细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞） 荧光显微镜观察 图9A 未处理的HL-60细胞 图9B DADS处理的HL-60细胞 吖啶橙 ×40 吖啶橙 ×40 3 电子显微镜观察法 　 电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特点，如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失、染色质固缩和线粒体超浓缩等，但由于样本制备复杂、耗时，该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测。 3 透射电镜观察 图8A 未处理的HL-60细胞 图8B DADS处理的HL-60细胞 透射电镜×6000 透射电镜×6000 4 DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳“梯形条带”图谱法 原理：凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为200-300kb和30-50kb的片断（“结构域式”剪切），再进一步降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体片断（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在琼脂糖凝胶电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性“梯子”样外观。 注意事项：梯状DNA(DNA ladder)现象常被看作是细胞凋亡的重要生物化学标志。但是，日益增多的资料显示并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子样外观。因此，缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在。据报道，某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双链DNA降解，故不能形成“DNA ladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈现典型“DNA ladder” 。故有DNA ladder可以肯定凋亡存在，没有DNA　 ladder不能排除凋亡的存在。 ５.TUNEL法（末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法） 原理：DNA聚合酶能够填补双链DNA中的单链缺 失部分，应用放射性同位素、生物素和荧光素等标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。 TUNEL法是在含标记dUTP的反应体系中，加以末端DNA转移酶。故又称为TdT(terminal deoxy-transferase)法。该法是应用无需模板的DNA聚合酶，延伸核苷酸的碱基序列与DNA底物无关。 注意事项：该法只能了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量，虽然在理论上对这种方法的特异性尚有争议，但操作简便，并且可大量应用于回顾性研究，从而成为目前较为流行的细胞凋亡评价方法。 TUNEL检测结果 图10A 未处理的HL-60细胞 图10B DADS处理的HL-60细胞 TUNEL ×20 TUNEL ×20 6 PI染色流式细胞术测定凋亡率 原理：实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分子量DNA 外漏，导致细胞内DNA含量减少。因此，应用DNA特异荧光染料（如碘化丙啶，propidium iodide, PI）染色后，在FCM进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常以亚二聚体形式出现。亚二倍体细胞群被称为亚G1期（sub-G1)细胞。它的出现被认为是凋亡细胞的重要标志。 注意事项：识别亚G1期细胞的同时，必须将它和细胞碎片区分开来，因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞。 2.3 流式细胞仪检测凋亡率 control 5mg·L-1DADS 7.5mg·L-1DADS 10mg·L-1DADS 3.3 流式细胞仪检测凋亡率 细胞凋亡死亡受体相关信号途径