相关实验操作.pdfVIP

1．细胞培养 2 ．RNA 相关技术 3 ．蛋白质相关技术 4 ．流式细胞仪 5．免疫组化 6 ．Luciferase 报告基因系统 7 ．细胞功能实验 8 ．分子克隆相关技术 细胞培养 配制培养液 基础培养液（DMEM 4.5g/l 糖） 90% 血清FBS： 10% （可减至5% ） 双抗（青霉素与链霉素）：1% NEAA(非必需氨基酸)：1% CIP （环丙沙星）：千分之一 L-G （左旋谷氨酸）：1% 混匀，4 度保存 培养液用量： P100: 5-6ml 培养液 P60：2-3ml 培养液 6 孔板：2ml 培养液 小瓶：3-4ml 培养液 大瓶：5-6ml 培养液 复苏细胞 1、提前准备好15ML EP 管，37 度水浴锅，培养皿加好培养液。标记。 2、从液氮罐迅速取出细胞，放入37 度水浴解冻2min 至液体状。 3、喷酒精消毒，吸出细胞于15ml EP 管，用培养液约1ml 洗涤冻存管残留细胞加入EP 管中。 4 、加入少量培养液，混匀。 5、800rpm，4min 。 6、弃上清，加入1-2ml 培养液重悬。 1、接种细胞。可24 小时后换液1 次，一般2 天换液，3-4 天传代。根据培养液情况调整。 细胞传代 2、吸去培养液，加入2-3 ml PBS 洗。 3、吸去PBS，加入1-2ml 胰酶，37 度消化（根据不同细胞消化不同时间） 4 、显微镜观察，至细胞呈圆形正要飘起适宜。拍打一下培养皿至细胞飘起。 5、加入大于胰酶量的培养液终止消化。 6、反复吹打使细胞飘起，移到15ml EP 管中。 7、800rpm，4min ，离心。 8、吸去上清，加入适当培养液重悬（宜多不宜少）。 9、接种细胞。可24 小时后换液1 次，一般2 天换液，3-4 天传代。根据培养液情况调整。 细胞接种数：根据细胞生长速度及实验要求调整。 P100: 1.2-1.6*10^6 个 小瓶：1-2*10^5 个 6 孔板：1.5-2*10^5 个 细胞冻存 1、配置冻存液：培养液：FBS：DMSO=7:2:1，一周内有效 2、吸去培养液，加入2-3 ml PBS 洗。 3、吸去PBS，加入1-2ml 胰酶，37 度消化（根据不同细胞消化不同时间） 4 、显微镜观察，至细胞呈圆形正要飘起适宜。拍打一下培养皿至细胞飘起。 5、加入大于胰酶量的培养液终止消化。 6、反复吹打使细胞飘起，移到15ml EP 管中。 7、800rpm，4min ，离心。 8、吸去上清，加入适当冻存液重悬。 9、冻存1-1.5ml。 冻存量一般1*10^6 个以上，根据细胞生长速度及实验要求调整。 结直肠癌细胞原代分离培养配液 1、转移培养基：1%NEAA （非必需氨基酸）+ 2.5 ug/ml amphotericin B （两性霉素B）(1:5000) + 200 ug/ml gentamycin （庆大霉素）(1:500) + 1%PS （双抗）+ 0.1%CIP （环丙沙星）+ basic DMEM + 4ug/ml insulin （胰岛素） （原代培养基-FBS=转移培养基） 2、原代培养基：10%FBS （胎牛血清）+ 1%NEAA （非必需氨基酸）+ 2.5 ug/ml amphotericin B （两性霉素B）(1:5000) + 200 ug/ml gentamycin （庆大霉素）(1:500) + 1%PS （双抗）+ 0.1%CIP （环丙沙星）+ 90% basic DMEM + 4ug/ml insulin （胰岛素） 3、传代培养基：10%FBS （胎牛血清）+ 1%NEAA （非必需氨