高密度发酵概要.pptVIP

第九节 高密度发酵 高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。 高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而达到降低生产成本，提高生产效率。 一、影响高密度发酵的因素 培养基；溶氧； pH；温度；代谢副产物 1 培养基:高密度发酵对基质中营养源的种类和含量比要求较高，如碳源和氮源的比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；比例偏大，则菌体繁殖数量少，细胞代谢不平衡，不利于产物积累。 葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源，但浓度过高，会产生乙酸，因此要保证较低的葡萄糖浓度。 氮源、微量元素和无机盐对细菌的生长繁殖和外源蛋白的表达也有很大影响。 2 溶氧浓度 随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。特别是高密度发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓慢，外源蛋白的表达量也较差。 在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度，必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。 在一定范围内，通气量越大，溶氧浓度越高。 若气流速度过大，会使发酵液产生大量泡沫，使罐的有效利用率降低。 3 pH 大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，特别是大量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必须调节pH在适宜的范围。 4 温度 培养温度在适宜的范围，对于温控诱导表达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时间对于重组蛋白的产量由很大影响。 5 代谢副产物 乙酸 二氧化碳 葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸，或者比生长速率过高，供氧不足，也会产生乙酸。为降低培养基中代谢副产物的积累，可采用流加补料的措施，或保持适当的比生长速率，或在培养基中添加某些氨基酸。 二 、实现高密度发酵的方法 1 发酵条件的改进 ①培养基的选择：采用甘油作为碳源 ②建立流加式培养：营养过高抑制细胞生长，高密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的，营养物是在需维持高生长速率是才添加的。 ③提高供氧能力：通入空气与氧混合气体；增加压力；发酵液中添加过氧化氢。 2 构建出乙酸化能力低的工程化宿主菌 通过发酵条件的改进可以减少乙酸的产生，但是难以做到精细的调控，通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成途径，构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上解决问题的途径之一。 ①阻断乙酸产生的主要途径：基因敲除或突变产生乙酸代谢突变菌株。 ②对碳代谢流进行分流：丙酮酸代谢有选择的向乙醇的方向进行。 ③限制进入糖酵解途径的碳代谢流：大肠杆菌对葡萄糖的摄取是在磷酸转移酶系统的作用下通过基团转位的方式进行的，通过基因敲除法限制葡萄糖的摄取速率。 ④引入血红蛋白基因：提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率。 3 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。 第八节 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质 。它的制得具有以下特点： ①表达产物在初始料中含量较低； ②初始物料组成复杂，含有大量细胞及代谢产物、残留培养基等。 ③表达产物稳定性差，易失活变性； ④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； ⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。 一、建立分离纯化工艺的根据 ⒈含目的产物的初始物料的特点 ①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养基的来源及其质量。③生产工艺及条件。 ⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求。 分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。 ③收率要高。 ④两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。 三、细胞的破碎方法 物理法：匀浆法；珠磨法和超声法 化学法：渗透冲击，增溶法 生物法：酶溶法 1、物理破碎法 匀浆法：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破裂的方法。 可以大规模应用，不适用于易造成堵塞的团状或丝状真菌。 高速磨珠法：将细胞悬浮液与研磨剂一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出内含物。 产生大量的热，必须采取冷却措施。