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学位论文开题报告 东亚蝎毒素AGAP中枢镇痛机制的研究 报告人：赵有龙 指导老师：张双全教授 曹鹏博士 目 录 前言 选题依据及意义 国内外研究进展 研究目标和内容 技术路线 进度安排 预期结果及创新之处 前 言 东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch，简称BmK )广泛分布于我国的辽宁、山东、河南等省和东亚地区。中医临床所用的全蝎主要是指东亚钳蝎，起主要生物活性功能的便是全蝎尾部所产的毒液。 蝎毒中含有多种生物活性成分，主要有由蛋白质（蝎毒素）和非蛋白质两组分组成。 根据其肽链的长短可分为蝎长肽毒素和蝎短肽毒素 蝎毒素按其作用受体的不同可分为： 东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide，AGAP)是刘岩峰在2003年从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化得到的单组分活性肽。AGAP成熟肽含有66个aa，因此属于蝎长肽毒素。 选题依据及意义 选题依据： 2003年刘岩峰等运用小鼠醋酸扭体模型和热板法实验研究表明,AGAP活性肽具有较强的镇痛活性。 本实验室于杰淼师兄通过小鼠醋酸扭体实验证明原核重组表达的AGAP具有明显的镇痛作用。而且，与相同质量的吗啡相比，重组AGAP具有更好的镇痛效果。 1996年李宁等研究证明蝎毒素有很强的中枢镇痛作用, 且镇痛作用强于吗啡4倍以上。 大量实验表明：与其他镇痛药相比， 蝎毒素具有较好的修复受损神经的功效，无其他副作用等优特点。 蝎毒素AGAP成熟肽同源性比较 钠离子通道简介： 1997年张瑞德等研究了辽宁产东亚钳蝎毒的某些活性物质对海马CA1区痛放电的抑制作用，其作用途径：一方面通过激活内源性阿片系统，另一方面还有其它途径；乙酰胆碱、五羟色胺与增强蝎毒的镇痛作用有密切的关系，蝎毒可增加乙酰胆碱的释放，从而协同蝎毒的镇痛作用 选题意义： 由于AGAP与其他镇痛药相比具有更好的应用价值，本文通过研究其镇痛作用的机制，进而为AGAP作为镇痛药物应用于临床实验提供科学依据。 国内外研究进展 国内研究进展 中医临床所用的全蝎主要是指东亚钳蝎，在我国中医史上已有2000多年应用历史。 自宋代以来，东亚钳蝎全虫便被视为一种名贵中药，用于镇痉息风、治疗风湿麻痹痛等。 根据《本草纲目》记载，蝎子具有攻毒散结、通络止痛的作用。 中国科学院上海生理所自70年代末开始了东亚钳蝎神经毒素的生化与镇痛药理学研究。 我国自20世纪80年代以来对蝎毒镇痛作用开展了广泛动物实验研究。 2003年刘岩峰等通过小鼠扭体和热板实验初步研究表明AGAP具有镇痛效应。 国外进展： 目前，国外对蝎毒新成分的纯化、活性、机理研究相当活跃，其中，蝎毒功能的研究中离子通道是一个焦点。 研究目标和内容 研究目标： 应用多种分子生物学技术从神经中枢系统方面研究AGAP作用的受体及其下游的信号通路，确定AGAP中枢镇痛的分子机制。 研究内容： 1、在体外分离单个背根神经细胞，借助Na+荧光染料SBFI 和钠离子通道阻断剂TTX证明AGAP镇痛作用的受体是钠离子通道 2、在体内，脊髓鞘内注射反义核苷酸研究AGAP作用受体亚型的类别。从mRNA和蛋白质水平分析AGAP的作用是否与受体亚型的表达量有关。制作背根神经组织冰冻切片确定AGAP的镇痛作用是否与受体亚型的重新分布有关 。 3、应用纳络酮特异性抑制阿片受体信号通路，检验AGAP镇痛机制与阿片受体类型的关系。 4、小鼠侧脑室给药后分离脑组织测定5-羟色胺(5-HT) 的含量说明AGAP是否通过提高中枢5 -HT的含量发挥作用。 5、mRNA水平上测定胞内痛指标c–fos的表达量，用于说明AGAP镇痛是否与调节c-fos 基因的表达量有关 。 进度安排 2009年7月－2009年10月：阅读文献设计实验方案 2009年10月－2009年11月：证明AGAP作用于细胞膜上的受体是钠离子通道 2009年11月－2010年1月：研究AGAP作用于钠离子通道亚型的类别以及是否与表达量和重新分布有关 2009年12月－2010年1月：AGAP对脑中枢神经的镇痛实验 2010年2月－2010年6月：撰写毕业论文，准备答辩。 预期结果及创新之处 预期结果: 1、AGAP作用于细胞膜上的受体是钠离子通道，且受体的亚型可能是Nav1.7、 Nav1.8和Nav1.9中的一种。 2、AGAP镇痛机制与阿片受体信号通路无关。 3、AGAP通过提高中枢5-羟色胺(5-HT)的含量来发挥作用。 创新之处： 1、联合应用脊髓鞘内注射AGAP和反义核苷酸的方法,研究确定AGAP作用于细胞膜上钠离子通道受体亚型的类别。 2、用钠离子荧光染料和冰冻切片技术从多方面分析AGAP镇痛作用与钠离