His标签蛋白纯化全攻略.PDFVIP

His 标签蛋白纯化全攻略 作为重组蛋白构建过程中最常用的标签，相信奋战在实验室中的小伙伴对 His 标签并不 陌生。His 标签可通过 Ni2+柱进行简单有效的纯化，不过纯化容易想要纯化好却并不那么容 易 。爱纯派助力 His 标签纯化，马上为大家送上 His 标签纯化全攻略。 His 标签蛋白的纯化原理 组氨酸（His）的残基上带有 1 个咪唑基团，可以和 Ni2+ 、Co2+等过渡金属离子形成配位 键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带 有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上，而其 他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的 His 标签蛋白可以通过提高缓冲 液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。 His 标签蛋白纯化说起来简单做起来难。小编也常常收到小伙伴们类似于“His 标签重组 蛋白 Ni2+柱纯化后纯度不够”、“His 标签蛋白挂不到 Ni2+柱上”等等之类的抱怨。其实呢，不 怕做不到，就怕没想到。His 标签蛋白纯化是有很大的优化空间哦~ His 标签纯化优化策略 His 标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和金属离子之间配位结合作用 力的强弱，而这种作用力主要和一下因素相关： 1）标签长度及暴露程度：最常用的 His 标签时 6 个重复的组氨酸，但在实际操作过程 中，根据实际情况可控制组氨酸的数目从四到十个不等。较短的标签与金属离子的 结合更弱，较长的标签与金属离子的结合更强 ；而标签的暴露程度也很容易理解， 金属离子只能和蛋白表面的 His 结合，所以 His 标签暴露程度越高，结合能力越强。 2 ）金属离子半径：除最常用的 Ni2+以外 ，但 Cu2+ 、Zn2+ 、Co2+等金属离子都可用于 His 标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，与 His 的结合能力也就越强。几种常用金属离子和 His 的结合能力为：Cu2+〉Zn2+〉Ni2+〉 Co2+ 。 3 ）缓冲液条件：His 标签蛋白在中性或弱碱性 pH 值（pH 7 到 8 ）环境下显现出比在酸 性条件下与金属离子更强的结合能力。在磷酸缓冲液中 His 标签蛋白表现出比在 Tris-HCl 缓冲液中与金属离子更强的结合能力。咪唑由于可以和 His 标签蛋白竞争 与金属离子的结合，所以缓冲液中咪唑浓度的升高，会导致 His 标签蛋白与金属离 子结合能力的减弱。一些可以鳌合 Ni 离子的试剂如 EDTA 或柠檬酸等等蛋白与金属 离子的结合能力有较大影响，应避免使用。 4 ）结合时间：一定范围内 His 标签蛋白与金属离子的接触时间延长结合能力自然就会 有一定增强 。 知道了与结合能力强弱有关的主要因素，大家知道在 His 标签纯化中遇到问题时应该怎 么解决了吧？ His 标签纯化常见问题 1 ：蛋白不挂柱 蛋白不挂柱说白了就是蛋白和柱子的结合能力不足导致的。根据上面说的几点影响结合 能力的因素，我们可以按照以下思路来排查下原因吧 。 1） His 标签还在吗？ 大肠杆菌表达外源蛋白过程中，有时候会出现序列丢失的现 象，若是标签丢失，蛋白自然无法挂柱了。那么检测方法也很简单，找个 His 抗体通过 Western-Blot 检测下立马知道结果了 。 2 ） 标签表达以后暴露在蛋白表面吗？ 在蛋白中加入适量的尿素或者盐酸胍等变 性剂看下蛋白能不能挂柱 ，若此时可以挂柱 ，说明蛋白表达过程中 His 标签可能 暴露不充分 。这个时候，可以尝试在变性剂存在条件下纯化，若不能接受变性 条件纯化，只能尝试上游修改了，要么增加 His 标签长度，增加暴露在外面的 His 个数，要么修改 His 添加的位置。 3 ） 选择了什么金属离子？如果选择的是 Ni2+或者 Co2