β-银环蛇毒素A1链基因的克隆及序列分析.pdfVIP

防化研究 2007年第4期 B．银环蛇毒素A·链基因的克隆及序列分析 王佳美 李艳军 王惠芳 张金平 应天翼 摘 要 为制备D-BGT ，链重组蛋白并进一步开展D-BGT的生物活性研究，在大肠杆菌中克隆了 D—BGT 链基因．从银环蛇毒腺中提取总RNA，经反转录PCR获得银环蛇毒素eDNA．根据D—BGT 链基 因的保守序列设计引物，以银环蛇毒素cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物连接到克隆栽体DUCm-T， 转入层coli Top1O感受态细胞中，经蓝白斑筛选，PCR鉴定为阳性克隆后测序．测序证明获得了 -BGT ， 链基因．测序获得的D-BGT ，链基因序列与文献报道的D—BGT t链的基因序列一致． 关键词 PCR，蓝白斑筛选，阳性克隆，大肠杆菌 得。本文在大肠杆菌中克隆了 B-BGT -链基因， 前言 为制备重组B—BGT 。链并进一步研究B—BGT的生 物活性打下基础。 B一银环蛇毒素(B-bungarotox in，B—BGT) 是具有磷脂酶A2活性的突触前神经性毒素，由A、 1 材料与方法 B两条不同的多肽链通过一个链问二硫键交联而 1．1 材 料 成” ’。A链是毒素发挥磷脂酶活性和致死毒性的 1．1．1 质粒与菌株 亚单位 ，B链是毒素的识别亚单位，可与位于突 pUCm—T载体，Biobasic公司。大肠杆菌 触质膜上的N型PLA2受体特异性结合 。链间二 ToplO，天为时代公司。 硫键由A链的Cys-15和B链的Cys-55组成，对 i．1．2 工具酶与试剂盒 于维持B—BGT活性构象具有重要作用。B-BGT亚 TaqPlusTaq酶，天为时代公司。T4DNA连接 毒素由A链和B链随机组合产生。目前已知的A 酶，promega公司。总RNA提取试剂盒、通用RT—PCR 链有8种 ，B链至少有6种，已发现的B-BGT 试剂盒，购自博大泰克生物公司。DNA凝胶回收 亚毒素至少有16种，这些亚毒素都具有神经毒 试剂盒，天为时代公司。 性…。最常见的B广B s亚毒素由A。、A 、A。和B。、 1．1．3 抗生素与培养基 Bz组成。B—BGT 链与蛇毒液和哺乳动物胰腺PLA。 氨苄青霉素，华北制药厂。蛋白胨、酵母提 的氨基酸序列同源，由120个氨基酸残基组成， 分子量13 500Da 。A链信号肽由25-27个氨基 取物，Oxoid公司。 酸残基组成 。A一链含 13个半胱氨酸，6对链内 1．1．4 主要仪器 二硫键。B—BGTn链与胰蛋白酶抑制剂、树蛇毒素 超纯水系统】Ililli—OPF：美国Millipore公司； 以及曼巴蛇毒素I、K序列同源，大约由60个氨 制冰机SctsmaliAf一10：意大利Icematic公司；恒 基酸残基组成，分子量为7 O00Da。B-BGT 链基 温摇床AGCH一4103：瑞士Infors公司；电子天平 因可从银环蛇毒腺为材料制备的eDNA文库中获 Sartori