骨髓间充质干细胞在重度烧伤大鼠心肌损伤中保护作用.docVIP

骨髓间充质干细胞在重度烧伤大鼠心肌损伤中保护作用 　　[摘要] 目的 探?骨髓间充质干细胞（BMSCs）对严重烫伤大鼠心肌的保护作用及作用机制。 方法 ①取10只健康雄性SD大鼠，采用全骨髓贴壁法体外分离大鼠BMSCs，流式细胞仪检测细胞表面分子标志物。②24只健康雄性SD大鼠，随机分为：对照组、模型组、治疗组。模型组及治疗组大鼠背部暴露于95℃热水浴18 s造成30% TBSA Ⅲ度烫伤，对照组暴露于37℃水浴18 s。水浴后即刻模型组及治疗组大鼠分别腹腔注射生理盐水10 mL（50 mL/kg），水浴后3 h模型组经尾静脉注射100 μL生理盐水，治疗组经尾静脉注射100 μL（2.5×107/mL）BMSCs。处理后48 h收集3组大鼠心脏组织标本及腹主动脉血，ELISA法检测血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）含量，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测心脏组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10及凋亡相关分子caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平。 结果 流式细胞术检测提示，所培养的BMSCs表达CD44、CD90、CDl05的阳性率分别为96.8%、99.72%、95.93%，而CD34、CD45阳性率分别为1.42%、2.17%；模型组大鼠血清CK、LDH含量显著高于对照组（P 　　[Key words] Burns； Myocardial injury； Cell apoptosis； Bone marrow stromal stem cells 严重烧伤患者早期即存在缺血缺氧性心肌损害，导致心功能减退[1-2]，炎性反应、细胞凋亡等因素与严重烧伤早期心肌细胞损害密切相关。研究显示：在抑制炎性反应、保护多脏器功能方面间充质干细胞具有明显的治疗效果[3-5]。但严重烧伤后，骨髓间充质干细胞（BMSCs）对心肌损伤是否具有保护作用，目前尚不明确。本研究通过体内旨在探究严重烧伤后，给予BMSCs治疗，观察对大鼠心肌损伤的影响，并探讨BMSCs可能的作用机制，进而为干细胞治疗严重烧伤脏器损害提供依据 1 材料与方法 1.1 主要试剂、实验动物及仪器来源 SD大鼠34只，质量（200±5）g，鼠龄6～8周、健康SPF级雄性，由第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK（军）2012-0022。IQ5TM实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪购自美国Bio-Rad公司；胎牛血清（批号：42F5150K），胰蛋白酶（美国GIBCO公司，批号：1394362），肌酸激酶（CK，批号：F16113）、乳酸脱氢酶（LDH，批号：F15212）ELISA检测试剂盒购自美国RD公司，CD34（批号：SC3742）、CD44（批号：SC7297）、CD45（批号：SC1178）、CD90（批号：SC53456）、CD105（批号：18838）购自美国Santa Cruz 公司。反转录试剂盒（批号：BK1001）、SYBR Green荧光定量试剂盒（批号：A8605）购自日本TaKaRa公司 1.2 大鼠BMSCs分离培养及鉴定 10只健康SPF级雄性SD大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg）麻醉后颈椎脱臼法处死，迅速剃除毛发，碘伏全身浸泡消毒5 min。超净工作台取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉骨骺端，用L-DMEM冲出骨髓，分离培养纯化BMSCs，选用第三代进行实验，采用流式细胞仪检测CD44、CD90、CDl05、CD34、CD45等细胞表面分子标志物 1.3 模型制备及分组处理 实验方案经第四军医大学西京医院医学伦理委员会批准（编号：XJYYLL-2015393）。24只健康清洁级雄性SD大鼠，饲养环境温度（23±2）℃，湿度50%，12 h照明、12 h黑暗适应性饲养1周。实验分组采用随机数字表法，随机分为对照组（假伤）、模型组（单纯烫伤）、治疗组（烫伤后BMSCs处理），每组8只。参照文献[6-7]构建动物模型，95℃热水浴18 s，制成30% TBSA Ⅲ度烫伤（经病理切片证实），实验过程：采用腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg）麻醉大鼠后背部烫伤区域脱毛，并给予仰卧位固定，95℃热水浴18 s，制成30% TBSA Ⅲ度烫伤，伤后即刻模型组和治疗组大鼠分别腹腔注射生理盐水10 mL（50 mL/kg），伤后3 h模型组经尾静脉注射100 μL生理盐水，治疗组经尾静脉注射100 μL BMSCs（2.5×107/ml）；对于对照组大鼠则采用37℃水浴18 s模拟烫伤过程 1.4 标本采集 实验过程中各组大鼠单笼饲养，自由饮食，各组大鼠48 h后麻醉，腹主动脉取血室温静置30 min后，1000