间接免疫荧光法测ANA-课件.pptVIP

间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA） 制作人：XXX 20XX-XX-XX 抗核抗体 【自身抗体】：指抗自身组织、器官、细胞及其成分的抗体 【ANA】：指抗细胞核成分（DNA，RNA，蛋白质和酶）的抗体。ANA存在一个谱 ANA新概念：抗核酸（Nucleic acid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称 某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内更丰富 ANA检测的意义 有助于疾病的诊断 如抗Sm是SLE标记抗体； 抗ScL-70 是SD的标记抗体； 抗Jo-1是PM/DM的标记抗体； 观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理 【ANA分类】 抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone) 抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable Nuclear Antigen, ENA） 抗核仁（Nucleolus） 实验原理： 生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。 【实验步骤】 实验步骤一：准备 检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的Sekusept Extra （汉高公司）中浸泡1小时。 只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。 实验步骤二：样品准备 1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。 实验步骤三：加样 在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。 加样体积: 25 μl/反应区(5 x 5 mm) 实验步骤四：孵育 将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温（18-25℃）温育30分钟。 实验步骤五：冲洗 用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。 实验步骤六：加样 将20μl荧光标记的抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。建议使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。 实验步骤七：孵育 从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。 注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。 检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。 从现在开始，注意避免阳光直射载片。 室温温育30分钟。 实验步骤八：冲洗 用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。 可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 μl)伊文氏蓝进行复染。 实验步骤九：封片 在盖玻片上滴加甘油/PBS。 封片体积: 10 μl/反应区(5 x 5 mm) 从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。 将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。 然后再进行下一个载片的操作。 实验步骤十：结果判断 荧光显微镜下观察荧光。 结果判读： 荧光显微镜下观察 ?细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。 【均质型】细胞核呈均匀一致的荧光 【核仁型】核仁部分呈现荧光 【斑点型】(颗粒型)细胞核内呈现斑点状荧光 【胞浆型】 【着丝点型】 ?混合型：存在两种以上的类型 【临床意义】 总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。 未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。 干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。 * * 几种ENA的由来及同义词 Sm：病人名：Smith RNP: u1 RNP或nRNP Nuclear Ribonucleoprotein SSA: RO Sjogren’s syndrome A SSB: La, Ha, Sjogren’s syndrome B Jo-1: 病人