基因突变检测策略要领.pdf

37 生命科学趋势 2003 年12 月 第1 卷 第4 期 Trends in Life Sciences 基因突变检测策略 1 2 1 3 张明 吴登俊 郑鸿培 刘玉良 1 四川农业大学动物科技学院胚胎工程与冷冻生物技术实验室 2 四川农业大学动物科技学院分子遗传实验室 3 四川农业大学动物科技学院胚胎工程与冷冻生物技术实验室在读硕士 （责任编辑 ：race） 摘 要：基因突变检测在疾病诊断、分子标记辅助选择上有重要的应用价值。随着人类基因组计划的推进，基因突 变检测技术手段得到了大的发展，本文简要阐述了目前各种直接针对遗传物质的直接的基因突变检测方法。 关键词：基因 突变检测 PCR 随着人类基因组计划的推进，鉴定并描述的人类致病基因越来越多，致病基因突变检测可以更加广泛 地用于临床诊断；随着动植物分子育种研究深入，主效基因标记精度越来越高。分子标记辅助选择逐渐成 为现实，高精度标记的检测实质上就是突变检测。由于突变检测在疾病诊断与控制、遗传改良上重要的应 用价值，大规模快速的基因突变检测研究受到了人们的高度重视。 基因突变检测可以从两个层次入手：一是蛋白质层次的间接检测，主要借助一些蛋白质分析技术，分 析突变体产生的变异蛋白，以及由变异蛋白引起的其他改变，如菌落形态，抗生素抗性等；二是对遗传物 质（主要是DNA ）的直接检测，一般而言，这类技术都是通过建立一系列电泳，分析DNA 构象或解链特 性，或者利用DNA 变性和复性等特性，进行DNA 突变的分析。由于PCR 技术的应用，基因突变检测主 要以分析DNA 变异的直接检测为主。下面简要阐述各种直接基因突变检测策略。 1 ．单链构象异构多态分析技术（ Single-strand conformation polymorphism,SSCP ） 迄今为止，SSCP 技术是最被广泛使用的。其基本原理是依据单链 DNA 在某一种非变性环境中具有 其特定的第二构象。DNA 序列甚至单碱基变化都能导致这种空间构象的改变，在非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳中，构象不同导致电泳迁移率不同，从而将正常链与突变链分离出来。但是PCR-SSCP 技术的突变出 率只有50%-80%，而且SSCP 的最适检测长度约为100-300pb。在SSCP 技术的基础上，发展起来PCR-rSSCP ， PCR-ddF ，PCR-REF 技术其检测效率更高。 1.1 RNA 单链钩象多态性检测（PCR-rSSCP ） 与单链DNA 相比，依赖链间互补的RNA 构象对单个碱基的取代更敏感。如果将PCR 引物加上某种 噬菌体启动子，比较转录后的待测样本与对照样本独特的RNA 构象体的电泳迁移差异进行突变鉴定。由 于电泳时无需稀释单链DNA 防退火，便可以大量上样以非同位素方法检测。rSSCP 检测200-400bp 序列 变异优于SSCP，检出率达到94%，此外，在此基础上改进得到了嵌套PCR-SSCP （αPCR-SSCP ）法。 1.2 双脱氧测序单链片段构象多态性分析（PCR-ddF ） 收稿日期：2003-11-20 接受日期：2003-12-04 作者简介：张明，目前在四川农业大学动物科技学院胚胎工程与冷冻生物技术实验室工作。 37 38 生命科学趋势 2003 年12 月 第1 卷 第4 期 Trends in Life Sciences ddF 是SSCP 的另一种改进技术，能够在相同条件下分析检测到几乎100%的突变。首先把PCR 产物 转录，再将转录本用逆转录酶进行Sanger 双脱氧终止测序反应。通过观察非变性胶上经解链处理所产生的 单链漂移，突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR-ddF 法能够精确定位突变于 10bp 的范围内， 假