08第8章 蛋白质和氨基酸的测定2013.ppt

第五节??? 氨基酸总量的测定 双指示剂甲醛滴定法 电位滴定法 茚三酮比色法(ninhydrin method) 双指示剂甲醛滴定法  1、原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，- NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。 2、方法特点及应用 此法简单易行、快速方便 在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。 脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低； 酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高； 溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。 3、试剂 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 0.1% 百里酚酞乙醇溶液（9.3-10.6） 0.1%中性红50%乙醇溶液（6.8-8.0） 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液 4、操作方法 样品溶液(氨基酸约20-30mg)2份，+50ml蒸馏水 1份，+3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定（红色—琥珀色，终点） 1份，+3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定（淡兰色，终点） 分别记录两次所消耗的碱液ml数。 5、结果计算 6、说明及注意事项 此法适用于测定食品中的游离氨基酸 固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液； 液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在500C水浴中进行0.5小时即可。 与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH基时的pH为8.5-9.5，但分析结果稍偏低，双指示剂法的结果更准确。 若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。 二、电位滴定法 1、? 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 2、 仪器 酸度计 磁力搅拌器 微量滴定管 3、 试剂 20%中性甲醛溶液：参考甲醛滴定法试剂 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液 磁力搅拌器 操作方法 pH8.2，计算总酸含量用, pH9.2, 记录碱液体积 试剂空白试验。记录空白消耗碱液体积 5、 结果计算 6、 说明 本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定 对于浑浊和色深样液可不经处理而直接测定 茚三酮比色法(ninhydrin method) 1、? 原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色(Ruhemann purple color)化合物（除脯氨酸外均有此反应）。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。 脯氨酸生成黄色化合物，440nm 1、? 主要仪器 2、? 试剂 4、 操作方法 （1）标准曲线绘制 （2）样品的测定 5、结果计算 总结 本章介绍了基于蛋白质和氨基酸的特性来测定蛋白质和氨基酸的方法，不同的分析方法由于其分析原理的不同，进而分析速度和灵敏度各不相同。 因为不同食品体系的复杂性导致各种蛋白质分析方法都可能会不同程度地遇到一些问题，快速地测定方法可能适用于质量控制，而灵敏的测定方法则是微量蛋白质分析所需要。间接的比色法通常都要使用经仔细选择的蛋白质作为标准或经正式方法校正（如凯氏定氮法）。 不同测定方法的比较 思考题Comparison of methods 样品处理 (sample preparation ) 原理 (principle) 速度（Speed） 本章重点与难点内容 1 基本概念：蛋白质系数、凯氏定氮法 2 比较几种快速测定蛋白质方法的原理、适用范围、特点及其注意点。 3 氨基酸总量的测定方法有哪些？ 4当选择蛋白质测定方法时，哪些因素是必须考虑的？ 蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时 继续蒸馏10分钟后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min 用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 三、自动凯氏定氮法 1、? 原理及适用范围 同常量凯氏定氮法 2、? 主要仪器 自动凯氏定氮仪 消化装置 3、? 试剂 硫酸铜和硫酸钾制成片剂 全自动凯氏定氮仪 含硝食品的测定 （增补内容） (一)方法提要 以硝酸盐、亚硝酸盐形式存在的氮在前述凯氏法中消化时一部分将成为硝酸和亚硝酸挥发损失。