葛根hplc指纹图谱的研究 - 中山大学化学与化学工程学院 - sun yat .doc

葛根HPLC指纹图谱的研究 吴颖妍，马志玲*，吴京洪* 中山大学化学与化学工程学院，广州，510275 摘要 本文尝试了用微波破壁，超声提取的新方法来提取葛根中的主要成分以利于高效液相色谱仪的检测，不断地优化色谱条件后，建立起较完整的葛根高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，而且发现不同产地葛根的HPLC图谱各有其特征，该特征在可作为葛根药材质量控制和鉴别提供依据；本文还对该方法进行了重现性试验，得到样品的各共有峰相对峰面积的RSD均小于5％，符合有关规定。因此可用该方法作为葛根内在质量的标准。 关键词 葛根；HPLC；指纹图谱； 前言 中药现代化是中药产业可持续发展的根本出路。近年来西方发达国家医药市场逐渐开始接受天然负荷药物，承认中国的中药复方是有临床疗效和安全的，但希望中药质量应做到可控。随着现代科学技术的飞速发展，如何评价中药质量，保证疗效，做到与国际水平接轨，已成为中药产业链仲所有产、学、研单位面临的重要课题。对此建立中药指纹图谱将是一个有效的手段。中药指纹图谱解决了中药化学成分复杂，尤其是解决了现阶段中药有效成分绝大多数没有明确、单一组分二不能表征中医治疗整体性这一难题，突破西药采用线性研究思维习惯。 中药指纹图谱是指运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，它全面反映中药的质量。中药大多来源于动植物，其同一物种由于遗传性有着整体的相似性。而鉴别单一中药材个体的对象为其后天的代谢产物，它对后天生长环境依赖性很强，同种药材所含的代谢产物可能产生个体间较为明显的差异，这就是中药指纹图谱分析依据。因而中药指纹图谱分析强调准确的辨认而不是精密的计算，比较图谱强调的是相似，而不是相同。在不可能将中药复杂成分都搞清楚的情况下，指纹图谱的作用是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。 高效液相色谱（high performance lquid chromatography，HPLC）Pueraria lobata (Willd.)Ohwi 或甘葛藤P. thomsonii Benth. 的干燥根。含有葛根素(Puerarin) 、葛根素木糖甙（Pueraria2xyloside）（Daizein）（Daidzin）（Isoflavone） 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 ?Agilent 高效液相色谱仪；依利特hypersil ODS2 (4.6mm×250nm，5μm)色谱柱；DAD 二级管阵列检测器；HP1100 色谱工作站 ?旋转蒸发仪型号： RE52CS 厂家：上海亚荣生化仪器厂 ?超声波清洗机：Model HN1006 厂家：华南超声设备厂 ?微波炉 ?试剂为分析纯：乙酸乙酯，无水乙醇，无水甲醇，苯（广州化学试剂厂） ?甲醇为Fisher 色谱纯。水为超纯水。 ?用于指纹图谱的葛根样品：广西(粉葛) ，安徽（野葛）(由致信药业提供)；广东(粉葛) 为药材市场所售商品药材。（以上样品均经由广州中医药大学中药药理研究室鉴定） 提取方法的选择 本实验尝试了用水和乙醇进行提取，分别用加热回流和超声、微波等提取方法进行比较提取效果。 以水做提取溶剂，提取液糖份含量较高，溶液粘稠，不利于进行HPLC检测；用加热的方法进行提取，耗时长，加热易不均匀，提取效果不佳。 因此本实验采用微波破壁，超声提取的方法，提取葛根中的主要成分。 2.3 色谱条件的选择 2.3.1 称取葛根样品40～60目粉末20g，用超纯水浸泡24小时。过滤后微波3min，再加入80％乙醇超声30min；过滤后滤液浓缩到一定体积，用20mL苯萃取。把苯层旋干，水层蒸干，用10mL纯甲醇溶解，待测。 2.3.2 参照物：取葛根素注射液20μL稀释至200μL，进样。 2.4 重现性测试 准确称取5份葛根样品40～60目粉末各5.000g，用超纯水浸泡24小时。过滤后微波3min，再加入80％甲醇超声30min；过滤后上HPLC检测。 2.5 不同产地葛根的HPLC指纹图谱的比较 准确称取安徽、广东、广西葛根样品40～60目粉末各5.000g，用超纯水浸泡24小时。过滤后微波3min，再加入80％甲醇超声30min；过滤后上HPLC检测。 3 结果和讨论 3.1 色谱条件的选择 图1．苯层－甲醇溶液HPLC谱图  图1.1 苯层－甲醇溶液HPLC局部放大谱图 图2．甲醇萃取溶液 图3．葛根素注射液 Fig.3 HPLC chromatogram of puerarin 通过用不同极性的溶剂对提取液萃取，得到提取液中不同极性物质的相对保留时间，从而设定洗脱梯度。 ?流动相为甲醇和水 ?梯度洗脱：0 ～ 2min ：甲醇10% 2 ～ 5 min ：甲醇10% ~ 20%