重组dna技术 dna的剪切与接合 限制内切酶 辨识dna分子中特定 .doc

重組DNA技術 DNA的剪切與接合 限制內切酶 辨識DNA分子中特定專一序列 成迴文、辨識並剪切 5’GCCAATTGGC3’ ? 3’CGGTTAACCG5’ 限制內切酶 在細菌中被發現 將外來噬菌體DNA切成片段 細菌本身DNA經過甲基修飾 不會被自己的酶切割 剪切雙股DNA ? (a)DNA水解脢隨意剪切 ? (b)特定限制脢在DNA相同序列剪切， 剪成鈍端 ? (c)特定限制脢在DNA相同序列剪切， 剪成黏接端 兩條不同DNA接合一起 DNA限制片段的分離與觀察 DNA選殖 ? 選殖的步驟包括： 分離DNA 把DNA接合到載體 把重組的DNA轉型到宿主細胞中 篩選含有重組DNA的宿主細胞 檢視含有重組DNA或是否產出適當蛋白質產物的宿主細胞 細菌的轉形作用和含有重組載體細胞的篩選 選殖載體 ? ＊選殖載體的條件： 具有複製起點，DNA才可以在宿主細胞中進行複製。 必須相當小才能在純化過程中不經裂解就可以分離得到。 具有許多單一特殊的限制酶作用位置以供選殖DNA片段 使用，也因此載體將只被剪切一次，而且必須擁有許多 可供插入DNA片段之限制酶作用位置可被利用。 具有選擇性的標記可以用來測定選殖媒介是否已轉移至 細胞中或顯示外來的DNA是否已經插入至載體上。 細菌載體 質體(plasmids)： 質體具有多種的功能。有些可轉譯出一些提供對抗生素的抗藥性與細菌素(bacteriocins)～能抑制或殺死與其同類的細菌株或菌種等物質。另一些可提供生理上的功能，例如：色素的製造、化合物的裂解、雙氮的固定等。還有一些可以製造毒素且具有毒性的質體轉譯內毒素與溶血素(hemolysin)，而有些質體則提供對金屬的抗性，例如汞、鎘、鎳、鋅。 pBR322質體的限制圖譜 經過轉形後進行重組細胞的篩選 pUC18/pUC19 之限制圖譜 利用篩選出白色菌落挑出含有重組DNA的細菌菌落 噬菌體(bacteriophage) 細菌體的溶解細胞生活史 將細菌限制脢處理的DNA片段 黏接質體(cosmid) 其他生物體適用之載體 酵母人工染色體：應用在大DNA片段-200 kb 細菌人工染色體：100-300 kb 植物選殖載體：農桿菌（Ti質體） 哺乳動物細胞載體：SV40, Retrovirus, Adenovirus 利用：農桿菌菌株將DNA送入植物體內 細胞轉形 利用電子槍將包覆DNA的發射器送入細胞內使細胞轉形 DNA經由顯微注射法被注入動物受精卵內的早期細胞中 基因庫的建構與篩選 基因體基因庫 cDNA基因庫 篩選基因庫 表現基因庫 cDNA基因庫 ? 利用一個只含有某型式細胞中已表現的基因所構成的基因庫，有時較為可行（例如：黃豆 中屬於葉子專一的cDNA）。這種基因庫稱為cDNA基因庫，因為只表現基因體DNA的某一 部分，大大地降低了DNA選殖的數量。 在選殖DNA中探針雜合至單股DNA 表現基因庫 ? 表現基因庫(expression libraries)是由含有基因表現所需之調控元件，如：啟動子區域的選殖 載體所組成的。 用於生產重組蛋白質的宿主細胞範例 報導基因 在很多細胞中，報導基因已經被用來偵測許不同的生物體的基因表現（例如：植物、動物、魚和細菌）。 其他被利用的報導基因還包括：綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、β～葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)基因。 利用螢火蟲螢光素脢基因轉形的煙草植物 南方墨點雜合法 在１９７０年代中期 Edward Southern發展 一個稱為南方墨點法(southern blotting)的簡單技術 此技術將DNA片段從膠片上轉移至另一片特殊的濾膜上 之後再進行雜合反應 北方墨點雜合法 RNA取代了之前所提的DNA 利用類似於DNA轉漬的方法，也可將RNA從膠體轉移至濾膜上。 北方墨點法用於確認所分離到的RNA與研究某特定基因的表現方面是相當有用的。 聚合酶連鎖反應法(PCR) PCR的應用 使我們可以很快從所有DNA中分離出我們所要的特定基因或是其它的DNA區域，不須費時於基因庫篩選工作。 PCR常見的應用如下： １快速分離特定的序列以提供更進一步的分析或選殖 ２確認特定的遺傳基因座以供臨床或醫藥的應用 ３製作DNA指紋以決定遺傳上的關聯性或刑事鑑定 ４快速進行DNA定序 讓特定DNA序列倍增的有效方法 短片段DNA叫寡核甘酸可作為提供特定DNA被DNA聚合脢複製的引子。 在試管中大約有18-21個核甘酸引子可以和DNA模版間利用鹼基配對，並開始複製。 DNA定序 在１９７７年，有兩種DNA定序方法首先被發表出來。哈佛大學A. Maxam與W. Gilbert發現一種可以選擇性分解鹼基的化學定序法另一種由F.