牛种布鲁氏菌2308株wbkA、pmm基因缺失株的构建及免疫效果的初步研究.pdfVIP

课题来源 973 计划项目 项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究 项目编号：2010CB530203 国家自然科学基金项目 项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究 项目编号 摘 要 布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的一 类人兽共患的慢性传染病，目前在我国以及世界上大多数国家有比较广泛的流 行。该病原菌可感染多种家畜及人，还可感染野生动物，近来还发现该病菌还可 感染海洋动物。人类感染布鲁氏菌用抗生素治疗需要持续几个月但不是完全有 效，对人类而言没有有效的疫苗，有几个许可的活疫苗可以在牲畜上使用，而这 些动物疫苗的效果取决于宿主的种类、免疫剂量、免疫途径。目前世界各国对布 病的防控都主要采用的是疫苗接种，然而又因现用疫苗都普遍存在毒力较强，可 引起怀孕母畜的流产，甚至还可感染人等缺陷，同时使用了疫苗后难以区分自然 感染和疫苗免疫，从而限制了疫苗的实际应用。因此，本研究拟通过缺失牛种布 2308 wbkA pmm 鲁氏菌 的 ， 基因构建相应的缺失株，初步评价其毒力和免疫保 护效果。同时表达了WBKA，PMM 两个蛋白，开发出一种能有效区分自然感染 和疫苗免疫的布鲁氏菌弱毒基因缺失株，旨在筛选具有潜在应用价值的疫苗候选 株。本文所做的主要工作及成果如下： 1. 2308 wbkA pmm 布鲁氏菌 株 和 基因缺失株的构建及鉴定：以牛种布鲁氏 菌2308 为模板高保真扩增wbkA和pmm基因上下游同源臂，以枯草芽孢杆菌为 + 模板高保真扩增SacB基因，将得到的上下臂SacB与分别连接到pGEM-7zf ，构 pGEM-7zf-∆wbkA-SacB pwS pGEM-7zf-∆pmm-SacB ppS 建 （ ）和 （ ）。自杀载体 + + + pGEM-7Zf 上，分别构建成pGEM-7Zf -ΔwbkA和pGEM-7zf -Δpmm，制备牛种 2308 pwS ppS 布鲁氏菌 感受态，电转化重组质粒 和 ，通过氨苄、蔗糖的两次筛 选得获得ΔwbkA和Δpmm基因缺失株，进行遗传稳定性检测。 2. ΔwbkA和Δpmm基因缺失株的毒力及免疫效果的初步评价：在小鼠巨噬细 RAW264.7 ΔwbkA Δpmm 6 胞 水平初步验证 和 的毒力；用缺失株免疫 周龄昆明白 小鼠，通过CFU 计数初步评价缺失株的毒力；通过常规血清学试验初步验证小 鼠体内的抗体水平，采用间接ELISA 方法检测小鼠体内总IgG 水平以及细胞因 子IFN-γ的水平；对用缺失株免疫30 d 后的小鼠进行攻毒试验评价其保护效果。 3. pET-wbkA pET-pmm PCR 构建原核表达载体 和 及鉴别诊断：用 方法分别 wbkA pmm 扩增 和 基因，将测序正确的基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体 pET-32a 上，然后转化至大肠杆菌DE3（BL21）中诱导表达并纯化WBKA 和PMM