精氨酸激酶-AK课件.pptVIP

蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。 洗脱体积与相对分子质量的关系 电泳 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。 电泳技术分类 5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 预处理： (1)用2 M盐酸胍10 mL与树脂打散混合洗涤； (2)用Stripping Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟； (3)1.5 M盐酸胍洗30分钟，蒸馏水洗30分钟； (4)用1 M NaOH洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟； (5)用1.5 M NaCl洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟； (6)Ni柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4洗→蒸馏水洗（穿流液无色）→Binding Buffer平衡。 研究背景 精氨酸激酶的简介 无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）， 是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用 。AK在体内催化反应方程式如下： 主要实验仪器 紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、 ORION pH计、 紫外检测仪、冷冻离心机、 超声破壁仪 、雪山制冰机、 超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、 单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅 实验内容 1 活化菌种 取50 μL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 μg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。 2 扩大培养 将试管中活化的3 mL菌液接种到100 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度50 μg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3 小时。 3 IPTG诱导AK的表达 实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入 IPTG诱导表达发现，当温度为22 ℃，OD=0.6-0.8时，IPTG终浓度为0.5 mM时AK的表达量达到最大。 4 蛋白质提取 （1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10分钟； （2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g 沉淀加5 mL裂解液； （3）在冰上进行10分钟，间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止； （4）于4 ℃，12000 rpm，离心10分钟，取上清，得到AK的粗提液。 平衡：6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡。 上样：插A280滤光片，调A值（0）、T值（100）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min。 洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（20 mM、40 mM、80 mM、100 mM、150 mM）洗脱。在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。 6 AK的检测 SDS电泳： （1）安装双垂直板电泳槽； （2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL； （3）制样：取样品20 μL与样品缓冲液10 μL混合，100 ℃加热5分钟； （4）上样：用微量注射器加样15-20 μL （5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部； （6）固定和染色：用