蛋白质下游纯化解决的方案专帖.docVIP

【专题讨论】生物制药产业化及膜分离技术，下游纯化解决方案专帖！ 请教一个关于超滤浓缩疫苗(病毒)的问题目标病毒是20~22nm但是超滤膜是以kd表示的不知道nm和kd对应关系如何我应该选用多大截留分子量的膜包合适 啊谢谢前辈指导你可以考虑用截流分子量为100kDa的超滤膜，对于疫苗应该没问题。另外，还应该看杂质的种类和大小。一般地，浓缩疫苗，选择的原则是100KD和300KD为多。更大的500KD和900KD也有用，但是很少。至于换算，粗略的是1nm对应9~11KD。但是您最好是以实验为准。 血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5～pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化?含血清的培养，会受血清中多种杂蛋白影响，纯化难度较大。不知道你的表达量有多少，血清百分之几？可以考虑阴离子capture，但是注意phenol red, 核酸以及多种杂蛋白都会binding，所以要先建立比较灵敏的assay方法，如Elisa，用于监测纯化整个过程。目标蛋白等电点和BSA相差不多，第一步很可能分不开，后面可以考虑用HIC进行精纯。 我的建议是先得到澄清液体，然后用切向流去除小分子杂质，然后层析分离。为保证二聚体不解离，二硫键不断裂，建议整个过程考虑pH值，还有还原剂。 haibei00 wrote:血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体，由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5～pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化? 对于血清培养细胞，可以先考虑用盐析沉淀进行粗提后，再用凝胶过滤和阴离子交换柱，如Q Sepharose FF或DEAE Sepharose FF进行分离。 ligand wrote:你可以考虑用截流分子量为100kDa的超滤膜，对于疫苗应该没问题。另外，还应该看杂质的种类和大小。 一般的疫苗用100K应该没有问题。但是对于这么小的病毒，用100K，可能会影响回收率。建议实验后决定孔径选择。 ligand wrote:对于血清培养细胞，可以先考虑用盐析沉淀进行粗提后，再用凝胶过滤和阴离子交换柱，如Q Sepharose FF或DEAE Sepharose FF进行分离。 这样做肯定没有问题。但是下游纯化是生物技术的主要成本所在（90%？，95%？更多？）。如何使填料的寿命延长以减少成本，是我们工艺选择时候考虑的。有些时候，多个步骤可能会更有利于获得理想结果。如果要是实验室研究， 那是另外一回事。盐析要考虑条件。别把目标蛋白一起去了。是与否，请参考。 我们用PVDF 0.22um的滤芯过滤培养液用后总是清洗不干净听说不能用碱洗我们又打算反复使用希望大家给一个过滤器清洗建议吧我们的产品是蛋白或者抗生素. 羟丙甲纤维素药液过滤问题：我们曾尝试1微米和5微米预过滤器的过滤,结果很快就堵住了，过不了,急啊。各位前辈能给点建议吗,非常感谢!!!0.5%羟丙甲纤维素、0.5%氯化钠.动力黏度（用平氏黏度计测）范围为10—32mpa warmice1 wrote:我们用PVDF 0.22um的滤芯过滤培养液,用后总是清洗不干净,听说不能用碱洗,我们又打算反复使用,希望大家给一个过滤器清洗建议吧. 我们的产品是蛋白或者抗生素. 可以15min 用碱（0.2M)清洗。然后迅速用水洗干净。 swordhearter wrote:羟丙甲纤维素药液过滤问题：我们曾尝试1微米和5微米预过滤器的过滤,结果很快就堵住了，过不了,急啊。各位前辈能给点建议吗,非常感谢!!!0.5%羟丙甲纤维素、0.5%氯化钠.动力黏度（用平氏黏度计测）范围为10—32mpa 以下几点建议：1，选择合适的过滤器；2，根据过滤器的使用条件选择合适的压力。3，欲速则不达。粘度很大的料液，不能要求太快，或者加大使用面积。 warmice1 wrote:888老师.谢谢!我们试过,但是通量下降. 您方便详细描述一下？ 我们用碱清洗后,发现PVDF滤膜过料液变得很慢. warmice1 wrote:我们用碱清洗后,发现PVDF滤膜过料液变得很慢. 你描述还是很简单.过滤器除了滤膜的材质之外,还有支撑层,保护支架,尖头,封口等.各部位的材质是不一样的.如果用碱清洗-------大多数是这么处理的. 不能长时间浸泡.不同的厂家生产产品是不一样的.所以不能一概而论.你还是需要详细说明. 我在毕赤酵母里分泌表达的一个融合蛋白存在降解加PMSF和EDTA都不能抑制降解 ，而且上清存放-20一段时间仍会继续降解，在做纯化过程中也会出现一系列降解的连续条带，实在太郁闷了，有人遇到过类似情况吗？大家有什么应付