几种酶分离山羊小肠上皮细胞方法的比较.pdfVIP

第 28卷第 6期 家畜生态学报 Vo1．28 NO．6 2007年 l1月 Acta Ecologiae Animalis Domastici Nov．2007 。 ‘。 。。 。 。 ’ 6科学试验2 ．o ．o ．o ．o ． 几种酶分离山羊小肠上皮细胞方法的比较 王海霞，匡 伟，赵国琦 (扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009) [摘 要] 用不同酶消化分离山羊小肠上皮细胞，从而找到最佳的分离方法，为进一步研究 IEC提供合适的细胞模型。本研究分别用胶原酶工、嗜热茵蛋白酶、胶原酶Ⅺ／中性蛋白酶I 消化分离刚出生未进奶的山羊小肠上皮细胞，通过观察IEC生长状态、形态特征、抗原鉴定比 较哪种分离效果最佳。结果表明，联合用胶原酶Ⅺ／中性蛋白酶工lh可分离出大量健全绒毛 隐窝单位，进一步培养获得的小肠粘膜上皮(IEC)，上皮细胞膜抗原均呈阳性，用胶原酶工和 嗜热茵蛋白酶分离得到的大部分是成纤维细胞。选用用胶原酶Ⅺ／中性蛋白酶工作为分离 IEC的消化酶，可获得较纯的IEC。 [关键词] 山羊小肠上皮细胞；胶原酶工；胶原酶Ⅺ／中性蛋白酶工；嗜热茵蛋白酶 [中图分类号] $811．5 [文献标识码] A [文章编号] 1004—5228(2007)06—0009—04 小肠是食物进行消化吸收的主要场所，而小肠 产品；表皮生长因子(Epidermal Growth Factor， 粘膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells，IEC)是肠 EGF)，胰岛素，0．04 的胰蛋白酶均为Sigma公司 道主要的功能细胞，参与肠道食物的消化、吸收、免 产品；青、链霉素，蔗糖为Amresco产品；胎牛血清 疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能有 (FCS)为杭州四季青产品，细胞角蛋白l8单克隆抗 密切关系。因此，进行小肠上皮细胞的分离培养是 体，SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒和苏 研究小肠功 能、营养物质吸收机制及其调控的主要 木素均购自武汉博士德公司。 手段之一。IEC体外培养难度大，国内尚无成功建 1．1．3 培养用液 DMEM培养基，添加lO 的胎 系的报道。我们参照Danes、Perreaut、Evans的分 牛血清、5~g／mL胰岛素、10ng／mLEGF、100U／mL 离方法，分别用胶原酶工、嗜热菌蛋白酶、胶原酶Ⅺ／ 青霉素、lO0~g／mL链霉素。蔗糖／EDTA缓冲溶 中性蛋白酶工作为分离肠上皮细胞的消化酶，进行 液：0．45mol／mL蔗糖，0．36 EDTA，0．1 牛血清 了山羊小肠上皮细胞的原代培养以及鉴定。 蛋白溶于PBS中，pH 7．4。100~g／mL胶原酶工。 50~g／mL嗜热菌蛋白酶。300U／mg胶原酶Ⅺ，0．1 1 材料和方法 mg／mL中性蛋白酶工。 1．1 试验材料 1．1．4 培养器具 超净工作台(VS—l3OOu)，二 1．1．1 组织来源 刚出生的徐淮自山羊羔羊，无菌 氧化碳培养箱(HERAEus)，倒置显微镜(OLYM— 条件下取出小肠，剔除肠系膜，放置在无血清的 PUS CKX41)，冷冻离心机(EPPENDORF)，电热恒 DMEM培养基中冰浴保存，备用。 温水槽(HHW一2lCU)，多孔培养板、培养皿和培 1．1．2 试剂和药品 DMEM培养基为Gibco公司 养瓶(SUMILON)。培养