病毒转基因技术原理 概述.pptVIP

课程背景 1980s, 转基因技术随分子克隆技术出现 2003年，我国SFDA批准了全球第一种基因治疗药物“今又生”上市。（State Food and Drug Administration） 2005年，我国SFDA批准了全球第二种基因治疗药物HB101上市。（国家食品药品监督管理局） 2009年12月18日出版的《Science》杂志将”return of gene therapy”作为年度重大的科学突破之一。 2012年12月欧盟批准地全球第三种基因治疗药物上市。 迄今，多达1900种基因治疗临床试验方案并正在进行临床试验。转基因技术正成为分子医学的一种革命性的技术手段，并已成为治疗许多遗传性和获得性疾病的潜在希望所在。 问题 社会公众对健康需求的增加 生命科学和医学研究的推动 对转基因技术的安全和伦理关注持续增加。 课程内容 分为理论课与实践课 转基因技术概述 病毒转基因技术原理、纯化制备技术和医学应用 生物安全 医学伦理问题 表达外源基因的复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定 DNA病毒 RNA病毒 杂合病毒 第一章 转基因技术概述 范雄林 86-27xlfan@hust.edu.cn 华中科技大学同济医学院病原生物学系 研究生高水平课程——《病毒转基因技术原理》 主要内容 基因转移方式 真核细胞的转基因技术 外源基因表达读框的构建原理 1. 定 义 基因转移（gene transfer）: 自然发生 转基因技术(transgene technology): 人工利用 2. 常见的基因转移方式 转化(transformation) 转导(transduction ) 转染 (transfection) 现象 定义 分类 用途 转化 （transformation ） 现象: 肺炎链球菌的转化试验 定义: 分类和应用:自然转化:感受态,宿主菌种类 人工转化: 低温CaCl2、电穿孔 小鼠的肺炎链球菌的转化试验 转导(transduction ) 现象:“U”型管实验 定义: 分类和应用:普遍性转导 局限性转导 局限性转导 转染 (transfection) 现象: 感染(infection)、病毒感染 定义: 广义和狭义 分类和应用:物理化学方法 生物学方法(病毒载体) 野生型病毒的自然感染、病毒载体转染和质粒经化学法介导的转染 3. 基因转移入真核细胞的方法 基因转移入真核细胞的影响因素 外源基因转移入真核细胞的类型和方法 构建外源基因的基本要素 转移入原核细胞的影响因素: 限制-修饰系统 质粒宿主范围和相容性 同源重组与非同源重组 基因转移入真核细胞的影响因素 真核与原核细胞具有显著区别; 外源基因要进入真核细胞，要突破三大障碍; 理想的转基因技术方法 质粒型载体: 物理方法 化学方法 外源基因转移入真核细胞的类型和方法 传统的针头注射 显微注射 粒子轰击 电穿孔 流体动力学 包裹微球 超声 磷酸钙法 脂质体法 DEAE-Dxtran法 常用的物理方法介导基因转移 物理方法 原理 材料 DNA用量 优点 缺点 传统的针头注射 外力 注射器 高 便宜、简单、便于应用于临床 效率比较低 显微注射 细胞内注射DNA 显微镜和显微注射针 低 适用于细胞水平的研究，不易降解 步骤繁琐，不适用于临床，专业技术要求高 粒子轰击 高压气体使微小的载体加速 不同的加速装置 低 对靶组织有很高的效率 需要很多的设备和步骤 电穿孔 电脉冲 电穿孔仪 低 高转染效率 未得到广泛认可 流体动力学 流体动力学的力量 特殊的注射器 中等 简单易于使用、转染效率高 组织局限性 包裹微球 胶囊化的微球包裹DNA 中等 控制下投递和释放 制备的质量控制 超声 超声仪超声 超声仪 中等偏低 安全、组织损伤小 技术不断发展、经验有限 外源基因转移入真核细胞的类型和方法 病毒颗粒型载体(病毒介导的转基因技术) 假型病毒载体（复制缺陷性病毒载体）：具有感染性 重组型病毒载体：具有感染性 DNA病毒载体：AdV, AAV,HSV-1,etc. RNA病毒载体: HIV, etc. 杂合型病毒载体