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* * 实验五 酶促反应动力学实验(Experiments on enzyme kinectics) 遵义医学院生物化学教研室 朱 欣 婷 生化教研室 朱欣婷 1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响。 3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的km值。 生化教研室 朱欣婷 酶促反应动力学: 影响酶促反应速度(V)的因素: 研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。 1.底物浓度 [S] 2.酶的浓度 3.温度 4.pH 5.酶的激活剂 6.酶的抑制剂 生化教研室 朱欣婷 （一）底物浓度对酶促反应速度的影响 当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两者成正比关系.随着底物浓度继续增加,反应速度增加,而幅度不断下降,若继续加大[S]反应速度就不再增加,达到一个极限值Vmax. Vmax [S] (V) 生化教研室 朱欣婷 [S]与V的关系:米-曼氏方程 Vmax -- 最大反应速度 Km -- 米氏常数 当V＝1/2Vmax时，Km＝［S］ Km值的物理意义:即Km值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。 生化教研室 朱欣婷 Km和Vmax值的测定 (1)测定不同底物浓度的反应初速率，以V-[S]作 图可以得到Vmax，再从1/2Vmax，可求得相应的 [S]，即Km值。 Vmax ? Vmax [S] v Km 生化教研室 朱欣婷 (2)双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒 数，以1/V-1/[S]作图，得出一直线. Km和Vmax值的测定 生化教研室 朱欣婷 （二）抑制剂对酶促反应速度的影响 酶的抑制剂： 抑制作 用类型 可逆性 不可逆性 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 凡能降低酶的活性，甚至使酶完 全丧失活性，但不使底物变性的物质。 生化教研室 朱欣婷 1.竞争性抑制曲线图 竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶与底物的结合. 特点: （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax不变 （3）Km增大，亲和力下降 生化教研室 朱欣婷 2.非竞争性抑制曲线图 抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合,不影响酶与底物的结合,底物与抑制剂之间没有竞争关系. 特点: （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax减小 （3）Km不变 生化教研室 朱欣婷 3.反竞争性抑制曲线图 特点: (1) V下降，发生抑制 (2) Vmax减小 (3) Km减小 生化教研室 朱欣婷 （三）本次实验方案 碱性 磷酸苯二钠 本次实验以 为底物, 为催化剂, 作为抑制剂，分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物浓度与酶促反应速度之间的关系。 磷酸酶AKP 磷酸氢二钠 生化教研室 朱欣婷 C6H5 N H3C-N H3C-C C-NH2 C=O H3C-N OH + C6H5 N H3C-N H3C-C C-N= C=O H3C-N O K3Fe(CN)6 OH- 4-氨基安替比林 醌衍生物 O-P=O ONa ONa 磷酸苯二钠 + H2O AKP OH HO-P=O ONa ONa + 酚 醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）,以1/V-1/[S]双倒数作图，获得Km值。 生化教研室 朱欣婷 添加试剂（两人一组，1人按照p45 ，另1人按照p50 的要求量取溶液） 37摄氏度水浴准确保温15分钟 立即加入碱性溶液1.10ml终止反应 0.3%4-氨基安替比林1.00ml 0.5%铁氰化钾2.00ml 每步充分混匀,室温放置10分钟 以0管调零,波长510nm比色 *