大黄酸衍生物rh01的抑制骨肉瘤生长作用及其作用机制研究.pdfVIP

中文摘要 后，连续给RH-01(30mg／kg／d和60 mg／kg／d)10天，然后 处死动物，取瘤子并称重，确定RH．01对实体瘤S180肉 瘤的治疗作用。 用无水乙醇溶解四环素和RH．01，定溶至 磷灰石，各样品在超声波振荡器振荡lmin后，室温平衡16h， 过滤后测定羟基磷灰石对四环素和RH一01的吸附值；昆明 RH．01(鬼臼毒素和大黄酸按l：1量合成，理论上，鬼臼 毒素的量应是相等的)，分别在12h和24h紫外分光光度仪 (254nm)测定骨对RH一01吸收情况和光谱图，并测定鬼臼 毒素、大黄酸、RH．01在体外的光谱图，进行体内外光谱图 比较，以RH．01转运至骨内的鬼酒毒素量来确定RH．01是 否具有骨靶向作用。 收集对数生长期的HOS细胞，加入药物RH一01 70％无水乙醇固定24h，PI染色后，用流式细胞仪检测不同 后对HOS细胞的影响。 收集对数生长期的HOS细胞，加入药物RH．Ol (O．0625～0．259mol／L)，次日，先后加抗微管蛋白的抗体： 外光激发下观察HOS细胞的微管蛋白变化并照相。从新鲜 猪脑中提取微管蛋白，用分光光度计和自动记录仪在波长为 350nm下测定化合物RH一01对微管蛋白的作用，并作时间． 吸光度曲线，根据时间一吸光度曲线确定RH．01对微管活 中文摘要 性的影响。 mRNA和周期素蛋白依赖蛋白 细胞的周期素蛋白cyclinDl 激酶CDK4mRNA表达的影响。 结果：通过生长曲线观察到RH．01对HOS细胞的抑制 蓝色荧光。给药组细胞形态变化明显，胞膜皱褶破裂，核碎 裂固缩，聚集成细小的凝聚块。随着药物浓度的加大，镜下 成形细胞数逐渐减少。 在昆明鼠S180肉瘤移植实验证实，RH．01在体内效果 明显，30mg／kg／d和60 mg／kg／d给药10天后的昆明鼠肉瘤 均比阴性对照组小，抑制率分别为64．54％署D77．26％，与对 照组比有显著性差异(PO．05)。说明RH．01在体内有明 显抑制S180肉瘤生长的作用。 羟基磷灰石吸附实验结果显示，羟基磷灰石对四环素和 RH一01的吸附值分别为8．1599mol／g和14．841gmol／g，证实 RH一01的趋骨性显著强于四环素；由紫外分光光度法测得 RH．01在骨内的光谱图和鬼臼毒素一样，并测得在254nm 波长时，给药12h的骨内经RH一01转运的鬼臼毒素量为 (PO．05)，表明RH．01在骨内已将结合的鬼臼毒素分解 出来，并且经大黄酸的骨靶向转运作用而使得骨内的鬼臼毒 素量明显提高。 流式细胞仪检测到RH一01对HOS细胞各时相都有所抑 中文摘要 制，其中24h时RH．01对HOS细胞各期的抑制作用最明显， 使G2+M期细胞的比例增加，G1期细胞的比例降低，S期 细胞的比例略为增加，且呈明显的剂量依赖性，表明RH．01 对G2期细胞向M期移行有一定的阻断作用；RH-01作用 36h后，已经检测不到完整的细胞，全部成碎片。通过免疫 荧光观察到RH一01对微管蛋白形态的影响明显，可见对照 组的HOS细胞微管保存完整，有时单根微管的轮廓亦清晰 辨，而用RH．0l处理后，细胞骨架则受到一定程度的破坏， 构成细胞骨架的微管数量明显减少、断片增多；在大剂量 RH．0l作用下，绝大部分细胞骨架破坏，仅在核周残留少量 点状荧光。 微管是由管蛋白和微管相关蛋白构成的蛋白质多聚体。 微管也是癌症化疗的靶点之一，在细胞外，微管蛋白在一定 的物理条件下(如温度)和化学环境(如PH值)中能够发 生微管蛋白的聚合(装配)和解聚(解装配)，作用于微管 蛋白的药物或化合物则能够抑制或促进微管蛋白的聚合或 解聚过程。本实验结果显示：小剂量(10“mol／L)RH一01 处理的微管蛋白聚合曲线在370C时达到峰值，但峰值低于 对照组，却高于鬼臼毒素组，40C时曲线下降；100pmol／L RH。0l剂量组的峰值明显低于对照组，且也低于鬼臼毒素 组，放入冰浴后RH．01组曲线也迅速下降。表明小剂量 RH一0l就能抑制微管蛋白的聚合，并呈剂量依赖性。 RT_