改良cdna末端快速扩增pcr筛选扇贝抗菌肽基因方法的实验研究.pdfVIP

改良cDNA末端快速扩增PCR筛选扇贝抗菌肽基因 方法的实验研究 中文摘要 【目的】 Peptide，AMP)基因的方法。 ● 2．应用改良3’eDNA末端快速扩增PCR法(RapidAmplification ofeDNAEnds， 黜忙E)和5’RACE法，进行筛选扇贝抗菌肽基因的初步研究。 【方法】 中 1．改良3’RACE法从扇贝血淋巴筛选抗菌肽基因 (1)从扇贝血淋巴中提取总RNA。利用M13和T7启动子分别修饰的基因特异 性引物(GeneSpecial 初步扩增，其后再利用M13和T7启动子序列进行嵌套PCRF增。 Easy载体，筛选阳性克隆 (2)3’RACE扩增产物经柱纯化后克隆至pGEM—T 进行DNA序列分析。 同源性比较分析。 (4)根据测序结果，对感兴趣的基因片段设计另一个基因特异性引物，进行 5’RACE，扩增该基因eDNA的5’端序列。 (5)57 RACE扩增得到的5端序列克隆至pCR4．TOPO载体，筛选阳性克隆进 行DNA序列分析。 同源性比较分析。 2．改良5’RACE法从扇贝血淋巴筛选抗菌肽基因 (1)从扇贝血淋巴中提取总RNA。 (2)根据贻贝抗菌肽MGI)s的保守序列设计基因特异性简并引物，进行改良 5’RACE钓取可能抗菌肽基因eDNA的5‘端序列，克隆至T载体，筛选阻性克隆进 行DNA序列分析。 (3)所得eDNA5’端序列应用BLAST程序与GenBank中的抗菌肽基因进行同源 性比较分析。 【结果】 3’ 1．采用改良3’RACE法从扇贝血淋巴RNA中钓取得到多个未知基因的eDNA 端序列，其长度在200 bp,-,800bp之间。 2．改良3’RACE产物成功克隆至pGEM—TEasy载体，挑选部分阳性克隆进行 DNA序列分析：获得了4个未知基因的3’端序列。搜索GenBank核酸数据库， 未发现与之高度同源的基因。 3．5号阳性克隆插入基因进行5’RACE扩增和克隆，挑选阳性克隆测序后获得长 度为448 bp的插入基因5’端序列。5’端序列和3’端序列经过拼接得到的5号克隆 插入基因eDNA准全长序列，其长度为544 bp。 4．搜索GenBank核酸数据库，未发现与5号阳性克隆插入基因准全长eDNA高 度同源的基因。 5’ 5．采用改良5’RACE从扇贝血淋巴RNA中钓取得到多个未知基因的eDNA 端序列。 6．在改良5’RACE产物中挑选长度在600 bp以下的三个基因片段进行AT克隆， 筛选出阳性克隆并进行DNA序列分析，得到3个插入片段序列，其长度分别为 257 1 bp和51bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库，未发现 bp、275 与之高度同源的基因。 【结论】 1．从扇贝血淋巴中获得的1个准全长eDNA、3个eDNA的3’端部分序列和3 个eDNA的5’端部分序列均可能属于新的基因。 2．应用改良RACE方法能钓取含抗菌肽保守序列的新基因片段，表明此方案具 有可行性。 关键词抗菌肽；双壳类；扇贝；RACE；基因；DNA序列分析 2 for AntimicrobialGenesin Screening Peptide Scallopb